细胞线粒体染色与超分辨成像

摘要：线粒体是细胞中的半自主性细胞器，是产生ATP的主要场所，且与钙离子调控，自噬，细胞凋亡等多种生物学过程相关。线粒体多呈棒状结构，由双层膜构成，内膜向内折叠形成嵴，增大了内膜的表面积。细胞中线粒体是一个高度动态的管状网络，彼此可以动态地发生分裂和融合。线粒体形态和功能的异常与多种疾病相关包括帕金森，阿尔兹海默症(de Moura et al., 2010)。此外，研究发现在衰老细胞中线粒体嵴发生变化，膜间隙变宽(Daum et al., 2013)。因此，实时观察线粒体的内部复杂结构和动态变化对于揭示线粒体功能以及线粒体相关疾病的机制具有重要意义。活细胞线粒体精细结构的观察需要使用荧光标记并运用超分辨成像，相比于内质网，溶酶体等其他细胞器，线粒体对光毒性更加敏感，因此对线粒体进行长时程实时动态成像具有巨大的挑战。本文介绍了使用低毒性荧光探针PK Mito Red (Yang et al., 2020)标记线粒体，并运用超分辨结构光显微镜Hessian SIM (Huang et al., 2018)的活细胞线粒体成像方法。

材料与试剂

材料：

1. 60 mm培养皿 (NEST, catalog number: 705001)
2. 35 mm 培养皿 (Cellvis, catalog number: 010035)
3. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: hlhjk0083)
4. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
5. 镊子 (solarbio, catalog number: 7238344 )
6. 玻片 (H-LAF10L玻璃，折射率: 1.788，直径: 26 mm，厚度: 0.15 mm，定制)
7. 夹持装置chamber (不锈钢，按玻片尺寸定制)

试剂：

1. PBS (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
2. HBSS含Ca²⁺, Mg²⁺,无酚红(Thermo Fisher Scientific, catalog number: 14025076)
3. 高糖DMEM (Gibco, catalog number: C11995500BT)
4. FluoroBrite DMEM (Gibco, catalog number: A1896701)
5. 胎牛血清 (Vistech, catalog number: SE100-B(6975))
6. 0.05% 胰酶-EDTA (Gibco, catalog number: 25300062)
7. 双抗Penicillin-Streptomycin (Gibco, catalog number: 15140-122)
8. 多聚赖氨酸 (Sigma, catalog number: P4707)
9. 无水乙醇 (康科德, catalog number: S6261)
10. 灭菌的双蒸水
11. DMSO (Sigma, catalog number: D2650)
12. PK Mito Red (见参考文献3)
13. MitoTracker Green FM (Thermo Fisher Scientific, catalog number: M7514)，MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher Scientific, catalog number: M7512)

仪器设备

1. 倒置显微镜 (Olympus, model: CKX41)
2. 超分辨结构光光显微镜Hessian SIM (见参考文献4)
3. CO2细胞培养箱 (Thermo Scientific Steri-Cycle 371系列)
4. 超净工作台 (Airtech, model: YJ-840型)
5. 低速离心机 (京立, model: LD5-2B)
6. 无油式电动吸引器 (鱼跃医疗, model: 7A-230)
7. 水浴锅 (国华电器数显恒温水浴锅, model: HH-1)

实验步骤

一、包被玻片

1. 用镊子将存储在无水乙醇中的玻片取出，并置于酒精灯火焰上方烧干，然后将玻片置于35 mm的培养皿中。
2. 取10-20 ul多聚赖氨酸均匀地涂在玻片中间，放置细胞培养箱中静置1-2 h或过夜。
3. 取出玻片，加入双蒸水至没过玻片，震荡清洗玻片，重复3次。放置细胞培养箱中静置1-2 h或过夜。

二、细胞培养

1. 将完全培养基，PBS，胰酶置于37度水浴锅预热15-20 min。
2. 取出培养在60 mm培养皿的cos-7细胞，置于倒置显微镜下观察，当细胞长至约90%可进行传代。
3. 弃去培养基，加入1ml PBS，轻轻摇晃培养皿并弃去PBS，重复2-3次。
4. 加入400 μl 0.05%胰酶，放入细胞培养箱静置约2.5 min。
5. 当细胞开始从皿底脱落，加入4 ml完全培养基终止消化，扫吹皿底使细胞充分脱落，并轻轻吹打细胞悬液使细胞大部分为单细胞。
6. 将细胞悬液转移至15 ml离心管中，800 × g 离心 3min。
7. 弃上清，加入4ml 完全培养基，轻轻吹打重悬细胞。
8. 取0.5-1 ml细胞悬液与包被有多聚赖氨酸的玻片上，加入完全培养基补齐至2 ml，并混匀细胞。
9. 放入细胞培养箱中培养16 h及以上。

三、细胞线粒体染色

1. 取出铺在玻片上的细胞，弃去细胞废液，加入0.5 ml HBSS洗3次。
2. 取0.5 μl 1 mM 的线粒体染料储液，加2 ml HBSS稀释成250 nM。
3. 加入500 μl 250 nM的线粒体染料，并置于细胞培养箱中静置15-20 min。
4. 弃去染料，加入0.5 ml HBSS洗3次。

四、超分辨成像

1. 用镊子将玻片从培养皿中夹出，并置于夹持装置中，加入300-500 μl成像培养基。
2. 打开Hessian SIM的硬件装置，包括倒置显微镜，位移台控制器，相机，激光器（含488 nm，561 nm，638 nm），打开活细胞工作站预热至37度。打开自主设计的成像软件（如图1）。
3. 将物镜切换至100倍（NA 1.7的油镜），往镜头上滴一滴镜油（折射率为1.78），放上夹了玻片的夹持装置。打开白光，调整焦距至清晰可见细胞。
4. 关闭白光，打开相应波长的激光（MitoTracker Green FM使用488 nm激光，MitoTracker Red CMXRos和PK Mito Red使用561nm激光），移动载物台寻找线粒体被标记的细胞，设置适当的激光强度，拍摄的张数（采集张数为9的倍数，SIM重构9张图合成一张）和拍摄间隔等成像参数进行成像。
5. 使用Wiener或Hessian解卷积算法对SIM图像进行重构。（重构程序见参考文献4的补充材料https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fnbt.4115/MediaObjects/41587_2018_BFnbt4115_MOESM21_ESM.zip）
6. 使用Image 软件对图像进行观察和分析。（Image J https://imagej.en.softonic.com/）

图1. 成像软件界面。红框为成像操作界区，蓝框为实时图像显示区，绿框为图像重构区。

结果与分析

线粒体内嵴结构是高度动态和复杂的，应用超分辨结构光显微镜Hessian SIM经过图像重构可以清晰地观察到嵴的结构和动态变化。

图2. COS-7细胞经MitoTracker Green FM染色后的线粒体重构前后图像。A 为SIM重构前图像，B为SIM重构后图像。可以清晰地观察到线粒体内嵴结构。激发波长：488 nm，曝光时间5 ms，帧频：22 fps ，比例尺: 2 μm

视频1. COS-7细胞线粒体嵴的长时间成像。左边为MitoTracker Red CMXRos，右边为PK Mito Red。从图中可见PK Mito Red比商业化的MitoTracker具有更低的光毒性，可以进行更长时间的实时成像。激发波长：561 nm，曝光时间7ms，帧频：10 fps ，比例尺: 2 μm。（图像来源见参考文献3）

注意事项

1. 线粒体染料染色后，需要替换新的培养基，染色时间不能过长（一般不超过30 min），否则会增加非特异染色并影响线粒体状态。
2. 线粒体染料储液可以分装成0.5 μl或1 μl每管置于-20度，避免反复冻融。
3. 成像培养基使用无酚红的培养基，酚红会造成较强的背景荧光。
4. 线粒体对ROS很敏感，激光长时间照射后会发生线粒体肿胀和ER的非特异性染色，在成像过程中需要用尽可能低的激光强度。若需要观察线粒体长时程的动态变化，可以设置1-10 s 的拍摄间隔。
5. 寻找目标视野时可以使用较低激光，拍摄使用较高激光。
6. COS-7是一种十分铺展的贴壁细胞系，易于成像，可以作为可视化研究细胞内生物学过程的工具细胞。

溶液配方

1. 完全培养基 (4度保存)
   DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清 + 1%双抗
2. 成像培养基 (4度保存)
   FluoroBrite DMEM DMEM + 10%胎牛血清
3. 1 mM线粒体染料储液 (-20度保存)
   使用DMSO将线粒体染料配制成1mM的储液

致谢

感谢陈良怡实验室全体成员的帮助，感谢陈知行实验室提供的PK Mito Red线粒体探针，感谢南京景瑞康分子医药科技有限公司提供的技术支持。本工作得到北京大学分子医学研究所，膜生物学国家重点实验室和北京大学分子医学南京转化研究院的大力支持。

参考文献

1. de Moura MB, dos Santos LS, Van Houten B. (2010). Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer. Environ Mol Mutagen 51(5):391-405. 
2. Daum B, Walter A, Horst A, Osiewacz HD, Kühlbrandt W. (2013). Age-dependent dissociation of ATP synthase dimers and loss of inner-membrane cristae in mitochondria. PNAS 110(38):15301–6.
3. Yang, Z., Li, L., Ling, J., Liu, T., Huang, X., Ying, Y., Zhao, Y., Zhao, Y., Lei, K., Chen, L., Chen, Z. (2020). Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science 11(32):8506–8516.
4. Huang, X., Fan, J., Li, L. Liu, H., Wu, R., Wu, Y., Wei L., Mao, H., Lal A., Xi, P., Tang, L., Zhang, Y., Liu, Y., Tan, S., Chen, L. (2018). Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol 36:451–459.