拟南芥叶片细胞核细胞周期检测

实验原理: DAPI (4，6-联脒-2-苯基吲哚)是一种荧光染料，可以非嵌入方式与细胞核内 DNA链上的A-T碱基对特异性结合，在355nm激光照射下，可以发射400 – 500nm的蓝色 荧光。利用具备 355nm 激光器的流式细胞仪，可以检测到已经标记了 DAPI 染料的细胞核， 实现对植物样品细胞核的倍性的准确分析。

实验目的: 可以检测拟南芥叶片中细胞核的 DNA 含量以及不同倍性。 

材料与试剂

1. 拟南芥叶片
2. 单面刀片
3. 尖头镊子
4. 过滤器，40um(BD)
5. 记号笔
6. 流式管，5ml (Falcon)
7. 冰盒
8. 培养皿
9. DAPI 荧光染料
10. 预冷的 GS buffer

仪器设备

实验步骤

1. 取样。
   用尖头镊子摘取拟南芥植株的子叶 15 对，备用。
2. 切样。
   取 600ul 预冷的 GS buffer 至培养皿中，将培养皿置于冰上。 用尖头镊子将摘好的拟南芥子叶转移至培养皿中的 GS buffer 中。 刀片垂直于样品，快速切样，直至叶肉细胞剥离，叶脉清晰为止。
3. 过滤。
   标记流式上样管。选择 40um 过滤器，将样品过滤至新的培养皿中。
   将过滤之后的样品，转移至流式上样管中。
4. 染色、避光孵育
   向样品中加入 DAPI 染料，终浓度 10ug/ml。
   避光、冰上孵育 10-15min。
   涡旋震荡之后，准备上机检测。
5. 流式上机检测
   选择有 355nm 激光器和 450/40nm 带通滤光片的流式细胞仪检测样品。

实验结果与分析

拟南芥子叶的细胞核经过 DAPI 标记后，表现为多倍性，即图形显示有多个峰， 每个峰代表一个倍性的细胞核。

注意事项

1. DAPI 和双链 DNA 结合之后，最大激发波长是 364nm，最大发射波长是 454nm， 所以必须选择有 355nm 激光器和 450/40 带通滤光片的流式细胞仪检测信号。
2. 为了防止细胞核在制备过程中DNA降解，整个制备过程在冰上操作，GSbuffer 也必须是预冷后使用。
3. 选择锋利的单面刀片，注意切样的方向和力度，避免过度切碎。

溶液配方

1. GS buffer 配方:45mM MgCl2，30mM sodium citrate，20mM MOPS， 0.1%Triton X-100，溶解在 ddH2O 中。
2. DAPI 原储液:用无菌水配制成 1mg/ml 的储存液，-20°C保存。