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小鼠2-cell胚胎移植

李庆, 史广用, 魏磊鑫李劲松 |  2020-12-29  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v627
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视频简介 小鼠2-cell胚胎移植是实验生物学、遗传学和发育生物学研究中的一项重要技术。通过体外受精(IVF)、卵胞质内单精子注射(ICSI)、卵胞质内类精子干细胞注射(ICAHCI)或受精卵胞浆注射等辅助生殖手段,所获得到2-cell胚胎均需要移植到假孕受体的输卵管中,使移植胚胎在体内进行正常的着床发育,实现获取不同发育阶段的胚胎或者小鼠模型的目的。本视频详细的展现了2-cell胚胎移植的主要实验步骤和关键技术难点,助力该技术的推广和应用。
  • 视频介绍

材料和设备:

  1. 动物:结扎的ICR雄鼠和发情的ICR雌鼠。
  2. 器械:直射光的实体解剖显微镜(Olympus)、反射光实体解剖显微镜(Olympus)、加热台、1 ml注射器、纸巾、细钝镊子、普通镊子、缝合线、口吸管、移植玻璃针、酒精灯、显微镊、止血钳和手术剪刀。
  3. 材料与试剂:麻醉剂(10 g 2,2,2-Tribromoethanol(Sigma, T48402)溶解于 10 ml 2-Methyl-2-Butanol(Sigma, 240486)中),KSOM胚胎培养液(Millipore, MR-106-D)、75%乙醇溶液和矿物油(Millipore, M8410)。

 

实验步骤:

  1. 发情ICR母鼠与结扎ICR公鼠合笼,12 h后,挑取阴道中有栓塞(白色)的ICR雌鼠作为假孕受体;
  2. 取假孕受体ICR母鼠,腹腔内注射麻醉剂使其麻醉,注射量依假孕受体体格而定;
  3. 在反射光实体解剖显微镜上,将麻醉后的小鼠置于喷洒过75%乙醇溶液的纸巾上,便于在显微镜下操作;
  4. 利用酒精灯和玻璃管,提前制备好的移植玻璃针(理想内径为1.5 - 2个胚胎的直径);
  5. 制备移植针气柱:吸入胚胎前先在移植玻璃针中吸入少量的矿物油,再吸入一个小的气泡,然后再吸入胚胎培养液KSOM,之后再吸入第二个小气泡,如此重复,直至能够稳定地控制液体的进出为止(一般气柱中含有3个气泡即可);
  6. 在直射光的实体解剖显微镜中,将辅助生殖获取的2-cell胚胎和尽可能少的KSOM吸入移植玻璃针中,然后将移植玻璃针放置在安全位置备用;
  7. 用75%乙醇消毒小鼠背部,沿着背中线从最后肋骨处开始用剪刀在皮肤上剪一个小口(约2 cm即可),通过背部切口可以观察到小鼠两侧的卵巢位置;
  8. 左手中指将左侧脏器向右侧顶,在右侧肌肉层上观察到红色卵巢后,用手术剪在卵巢或其上方脂肪垫处,开一个小口后用剪刀撑开,用细钝镊子拖着脂肪垫将整个卵巢、输卵管和部分子宫拉出,用止血钳固定脂肪垫;
  9. 在反射光实体解剖显微镜下找到输卵管与卵巢的连接部分和输卵管膨大的壶腹部,使用细钝镊子调整好输卵管的位置,以便于移植玻璃针很容易进入输卵管;
  10. 使用细钝镊子小心夹住输卵管与卵巢的连接部分,用1ml注射器针头在连接部分刺开一个小口,将移植玻璃针穿入输卵管的开口,在1ml注射器针头的辅助下,将移植玻璃针头部送入输卵管的壶腹部,注意玻璃针不要刺穿输卵管壁;
  11. 用口吸管将胚胎缓慢吹到壶腹部,若看到第一个气泡开始进入输卵管壶腹部,口部停止用力,慢慢抽出移植玻璃针;
  12. 松开止血钳,使用普通镊子提起开口的肌肉,用细钝镊子将脂肪垫连带着子宫、输卵管和卵巢送回小鼠腹腔;
  13. 重复步骤8-12,进行第二侧输卵管移植;
  14. 最后缝合小鼠背部开口,然后将小鼠置于37 ℃热台上,帮助麻醉状态下的雌鼠保温,直至雌鼠苏醒;
  15. 将孕鼠放入IVC笼子中饲养,可以在不同的发育阶段解剖获得胚胎,或者至E19.5天实现仔鼠出生。

 

注意事项:

  1. 背部皮层开口不易过大;
  2. 腹部肌肉层开口,避开所有血管;
  3. 在输卵管与卵巢的连接部分开口时,记住开口位置;
  4. 将移植玻璃针口送入壶腹部过程中,注意玻璃针不能刺破输卵管壁;
  5. 胚胎吹入壶腹部的力度要缓慢,及时停止。
[关键词] 胚胎移植、辅助生殖、假孕受体、体内发育
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