一、视频摘要
Solexa是一种基于边合成边测序技术（Sequencing-By-Synthesis，SBS）。通过单分子阵列实现在小型芯片（FlowCell）上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激光激发荧光集团，捕获激发光，从而读取碱基信息。读长在 100-150bp 之间，操作简介，数据质量高尤其是illumina高通量检测覆盖各个领域适用性高。
二、关键词（3-5 个关键词便于被搜索）
高通量测序、Miseq、测序技术
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
健康人的粪便样本
2. 试剂和耗材
2.1 文库构建试剂：TruePrep RNA Library Prep Kit for Illumina
货号 TR503
注：根据需要选择适用于实验的试剂
2.2 Miseq测序试剂：MiSeq Reagent Kit v3
货号：MS-102-3003
注：根据需要选择适用于实验的试剂
2.3磁力架：Invitrogen
货号：DgnMag Spin Magent
3. 仪器和软件
移液器：EPPENDORF
PCR仪：LabCycler Standard P
定量仪：Qubit4.0
质量评估：Agilng2100 G2938C
上机测序：Miseq测序仪
四、实验操作
Miseq建库定量上机
（一）、文库的定量、标准化和混合
基于Qubit定量结果进行换算
如：5ng/ul的Nana或Qubit定量结果，预估建库长度为500bp则，换算浓度为
5/（660*500）*106 = 15.3nM
根据计算结果，用10mM的Tris-HCl（pH 8.5）把文库稀释到终浓度为4nM。
（二）、文库稀释
测序前，混合文库会以NaOH进行变性，再用杂交buffer进稀释，当MiSeq测序前，再进行热变性。对于低多态性的文库来说，每一个run中需要加入至5%的PhiX用作测序质控。
准备工作：
1、800ul的水和200ul1N的NaOH。颠倒数次混匀。
2、把Miseq的试剂盒从冻存冰箱里取出，在室温下解冻。
3、准备一个冻桶，其中冰和水的比例为3：1。
DNA变性：
1、将最终的文库和新配的NaOH混合：5ul的4nM混合文库，5ul的0.2N的NaOH
2、在12小时以内，0.2N的NaOH与PhiX质控相混合，并保存。
3、旋涡振荡后，短暂离心。
4、室温静置5min，等DNA变性。
5、向文库中加入预冷的HT1（杂交液）：10ul的变性DNA，990ul的预冷HT1
结果是在1mM的NaOH中为20pM浓度的变性DNA文库，文库总量为0.02pmol。
6、所得稀释液置于冰上。
稀释变性DNA
1、变性DNA文库稀释到上机的终浓度。
当使用MiSeq v3时，原始簇（raw cluster）的密度是800-1000K/mm2。当第一次上机时，建议使用4pM的上机浓度，但可以随之调整。目前采用8pM。
2、短暂离心后，把反应体系置于冰上。
（三）、文库上机
1、取出测序试剂盒，放置于常温水中（注意不要漠过上线）。静置60~90分钟，直至完全溶解。
2、从水浴中取出试剂盒，上下颠倒十次混匀。擦干表面的水分。
3、创建Sample Sheet。注：特别注意设置barcode
4、开机，运行pre-Wash。约1小时。
3、点击“Sequence”，按页面指示进行。
五、注意事项
1、Miseq上机操作过程中注意浓度换算
2、Miseq测序当第一次上机时，建议使用4pM的上机浓度，后期逐渐增加，测序过程中注意库检时小片段（100b以下）的量，如果小片段过多，上机浓度太大会爆掉，因为在测序过程中小片段先长到芯片上的。
3、开始一个run前最好能配备一台UPS，以免测序过程中断电，这样损失比您买一个电池要大。
4、测序仪要定期维护，尤其在计划开始测序前一定检查，以免全都准备好了，测序仪出问题了。
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