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二代测序Miseq上机操作实验

强裕俊 |  2021-12-10  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v830
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视频简介Illumina测序技术为基于基因芯片的边合成边测序,整个平台可解剖为三个部分:一温度控制系统,原理和普通PCR仪一样,来控制反应的进行;二酶控制系统,通过各种酶来控制DNA合成与剪切;三荧光信号收集系统,可以理解为分辨率极高的照相机。在Illumina测序平台的(芯片)Flow cell表面,通过基因芯片技术交错固定了无数条寡核苷酸链(即短核苷酸链),分别为P5'(P5互补)和P7,在建库过程中,文库中每个DNA短片段的正链与反链都加上了P5与P7,因此建库后每个DNA片段都会扩增出两种结果,如果全部上机,最终两条链都会有测序结果。因为上机测序起始是以DNA单链为单位,单链化的文库DNA片段进入流通池后,包含P5或P7'的单链可以与表面的寡核苷酸基于互补配对结合,会随机的结合在不同位置,且相互距离足够远以保证测序信号的独立读取,从而进入测序过程。
  • 视频介绍
  • 评审评语摘选

一、视频摘要

Solexa是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-SynthesisSBS)。通过单分子阵列实现在小型芯片(FlowCell)上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基,再利用相应的激光激发荧光集团,捕获激发光,从而读取碱基信息。读长在 100-150bp 之间,操作简介,数据质量高尤其是illumina高通量检测覆盖各个领域适用性高。

二、关键词(3-5 个关键词便于被搜索)

高通量测序、Miseq、测序技术

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

健康人的粪便样本

2. 试剂和耗材

2.1 文库构建试剂:TruePrep RNA Library Prep Kit for Illumina

  货号 TR503

注:根据需要选择适用于实验的试剂

2.2 Miseq测序试剂:MiSeq Reagent Kit v3

  货号:MS-102-3003

注:根据需要选择适用于实验的试剂

 

2.3磁力架:Invitrogen

 货号:DgnMag Spin Magent


3. 仪器和软件

移液器:EPPENDORF  

PCR仪:LabCycler Standard P


定量仪:Qubit4.0

质量评估:Agilng2100  G2938C


上机测序:Miseq测序仪


四、实验操作

Miseq建库定量上机

(一)、文库的定量、标准化和混合

    基于Qubit定量结果进行换算

如:5ng/ulNanaQubit定量结果,预估建库长度为500bp则,换算浓度为

5/660*500*106 = 15.3nM

  根据计算结果,用10mMTris-HClpH 8.5)把文库稀释到终浓度为4nM

 

(二)、文库稀释

    测序前,混合文库会以NaOH进行变性,再用杂交buffer进稀释,当MiSeq测序前,再进行热变性。对于低多态性的文库来说,每一个run中需要加入至5%PhiX用作测序质控。

准备工作:

1800ul的水和200ul1NNaOH。颠倒数次混匀。

2、把Miseq的试剂盒从冻存冰箱里取出,在室温下解冻。

3、准备一个冻桶,其中冰和水的比例为31

DNA变性:

        1、将最终的文库和新配的NaOH混合:5ul4nM混合文库,5ul0.2NNaOH

        2、在12小时以内,0.2NNaOHPhiX质控相混合,并保存。

        3、旋涡振荡后,短暂离心。

        4、室温静置5min,等DNA变性。

        5、向文库中加入预冷的HT1(杂交液):10ul的变性DNA990ul的预冷HT1

           结果是在1mMNaOH中为20pM浓度的变性DNA文库,文库总量为0.02pmol

        6、所得稀释液置于冰上。

稀释变性DNA

    1、变性DNA文库稀释到上机的终浓度。

当使用MiSeq v3时,原始簇(raw cluster)的密度是800-1000K/mm2。当第一次上机时,建议使用4pM的上机浓度,但可以随之调整。目前采用8pM

        2、短暂离心后,把反应体系置于冰上。

 

(三)、文库上机

1、取出测序试剂盒,放置于常温水中(注意不要漠过上线)。静置60~90分钟,直至完全溶解。

2、从水浴中取出试剂盒,上下颠倒十次混匀。擦干表面的水分。

3、创建Sample Sheet。注:特别注意设置barcode

4、开机,运行pre-Wash。约1小时。

3、点击“Sequence”,按页面指示进行。

 

五、注意事项

1Miseq上机操作过程中注意浓度换算

2Miseq测序当第一次上机时,建议使用4pM的上机浓度,后期逐渐增加,测序过程中注意库检时小片段(100b以下)的量,如果小片段过多,上机浓度太大会爆掉,因为在测序过程中小片段先长到芯片上的。

3、开始一个run前最好能配备一台UPS,以免测序过程中断电,这样损失比您买一个电池要大。

4、测序仪要定期维护,尤其在计划开始测序前一定检查,以免全都准备好了,测序仪出问题了。

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缺少一定趣味性。
系统地讲解了Miseq上机操作流程,具有一定的运用性。
本视频详细展示了二代测序仪Miseq上机操作实验基本操作,视频拍摄清晰、完整,实验操作规范,且具有较强的实用性和创新性。
该视频细节完整,解说非常详细,是非常好的方法性视频。但注意事项和关键操作缺少细节展示。
普适性稍差,视频清晰度可提高。
本作品是对Illumina测序技术上机操作的一个详细演示过程,内容较完整,具有一定的实用价值。