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水稻原生质体的制备

高浩力 |  2021-12-10  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v845
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视频简介植物原生质体是一种已被证实具有生理功能的多功能细胞系统,绿色原生质体已经成功地应用于研究与激素、代谢物和环境挑战有关的植物信号转导途径。通过分离制备的原生质体可用于后续瞬时表达,蛋白质免疫印迹,亚细胞定位和蛋白质相互作用等。本次视频分享了水稻绿色组织原生质体的制备,而不是用黄化幼苗。
  • 视频介绍
  • 评审评语摘选

一、 视频摘要

植物原生质体是一种已被证实具有生理功能的多功能细胞系统,绿色原生质体已经成功地应用于研究与激素、代谢物和环境挑战有关的植物信号转导途径。通过分离制备的原生质体可用于后续瞬时表达,蛋白质免疫印迹,亚细胞定位和蛋白质相互作用等。本次视频分享了水稻绿色组织原生质体的制备。

 

二、关键词

水稻(Rice), 原生质体(Protoplast),二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate)

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

 

2. 试剂和耗材

(1) 75%乙醇

(2) 2.5%次氯酸钠

(3 )0.6M甘露醇

(4) 酶溶液:1.5% Cellulase RS (Yakult Honsha, Tokyo, Japan), 0.75% Macerozyme R-10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan), 0.6 M 甘露醇,10 mM CaCl20.1% BSA10 mM MES (pH5.7)

(5) W5溶液:154 mM NaCl125 mM CaCl25 mM KCl2 mM MES(pH5.7)

(6) MMG溶液:0.4 M甘露醇,15 mM MgCl2, 4 mM MES(pH5.7

(7) 0.5% 二乙酸荧光素(FDA)5mg FDA + 1mL 丙酮,4℃保存

 

3. 仪器和软件

(1) 恒温培养箱

(2) 荧光倒置显微镜

 

四、实验操作

(1) 水稻种子用75%乙醇灭菌1 min。这些种子用2.5%次氯酸钠灭菌20 min,用无菌水清洗至少5次,在26℃,光周期为12 h光照和12 h黑夜的1/2MS培养基上培养7~10天。

(2) 40-60株水稻秧苗的茎部组织用锋利的剃须刀切成大约0.5 mm的条状。

(3) 立即将水稻细条转移到灭菌的50 mL三角瓶中,加入30 mL 0.6M甘露醇,黑暗中放置10 min

(4) 100目钢制滤网去掉甘露醇后,将片段置于另一只灭菌三角瓶,加入20 mL酶溶液,在黑暗中温和摇晃(60~80 rpm) 4-5 h

(5) 酶解后加入等体积20 mLW5溶液,然后用手猛烈摇动10 s

(6) 原生质体通过40 μm尼龙网过滤进入圆底管,150 g离心3 min沉淀原生质体,用W5溶液洗涤3~5次,释放原生质体。

(7) W5溶液洗涤一次后,用MMG溶液重悬,放置冰上待用。

(8) 活性检测:100 μL原生质体溶液,加入μL 0.5% FDA溶液,避光静置5 min,用倒置荧光显微镜观察绿色荧光信号。

 

五、注意事项

(1) 利用培养基种植水稻一定将谷壳去掉后再进行灭菌处理,且在超净工作台中完成。

(2) 水稻原生质体较脆弱,为避免物理破坏,建议使用经过修剪的大开口移液器吸头。

(3) 本实验方法也可能适用于小麦等其它植物,但原生质体过滤使用的尼龙网孔径大小要根据具体植物组织进行调整。

 

六、结果分析(可选)

1. 利用FDA检测水稻原生质体存活情况

 

七、参考文献(可选)

Zhang Y, Su J, Duan S, Ao Y, Dai J, Liu J, Wang P, Li Y, Liu B, Feng D, Wang J, Wang H. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 2011 Sep 30;7(1):30. doi: 10.1186/1746-4811-7-30. PMID: 21961694; PMCID: PMC3203094.

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该视频清晰完整,能够较好的展示水稻原生质体制备的主要流程,同时通过字幕文字补充了一些视频未能展示的细节部分。但是有些关键细节未能说明,比如如何确定酶解液的量,此方法制备原生质体存活力具体数值等。
比较完整。
酶解完成后,通过剧烈震荡使原生质体释放的操作似乎欠佳,可能对原生质体完成比较大的损害,建议用去头的枪头轻柔吹大!