一、视频摘要
病毒诱导的基因沉默使用的是烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默体系进行辣椒基因沉默实验。在基因的3’非编码区及CDS区分别设计一对目标序列长度在300-400 bp之间的特异性引物,利用引物在辣椒cDNA文库里扩增出特异性目的片段,再通过Gateway技术将特异性片段构建在PYL279(TRV)载体上得到对应基因沉默载体,即:XXX-279,同时利用同样的方法构建阳性对照载体,即:TRV::PDS(八氢番茄红素脱氢酶,此基因沉默引起辣椒叶片的白化现象),在我们实验室标记为250。本视频系统介绍了病毒诱导的基因沉默的具体操作流程,为茄科作物辣椒的基因沉默提供参考依据。
二、关键词
烟草脆裂病毒;辣椒;病毒诱导的基因沉默
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1.样品信息
辣椒品种选择:HN42
2. 试剂和耗材
1、蛋白胨
2、NaCl
3、酵母
4、KAN
5、RIF
6、MES
7、MgCl2.6H2O
8、乙酰丁香酮
9、NaOH
10、去离子水
3.仪器和软件
1、分光光度计
2、恒温培养箱
3、摇床
4、超净工作台
5、PH计
6、冷冻离心机
7、实时荧光定量
四、实验操作
(1)扩增含有目的基因的农杆菌
1、在超净工作台中,将培养基加入到2ml离心管中
2、挑取单克隆到离心管中进行培养
3、分别是 TRVI EMPTY TRV::PDS TRV2-IC
4、将验证过的单克隆进行二次扩增培养
5、扩增好的农杆菌在摇床中黑暗培养
6、28摄氏度 150r 12h
7从摇床中取出培养好的菌液进行离心
8、28摄氏度 4500r 10min
9、离心好的菌液倒掉上清,保留下面沉淀
(2)调整农杆菌OD值
1、用分光光度计调整菌液的浓度
2、菌液的OD600等于0.8
3、将调好的菌液按照1:1等体积混合均匀
4、混合后的菌液放置在摇床中缓慢摇均匀
5、70r 28摄氏度 3h
(3)用侵染液对四叶期辣椒进行高压渗透侵染
1、取出摇好的菌液,进行注射
2、选取四叶期,长势均匀的幼苗
3、用注射器将子叶打满
4、注射好的幼苗在培养箱中进行培养。
5、16摄氏度 56h 黑暗处理
6、处理后的幼苗搬到正常光照处
7、15天左右出现白化苗。
(4)实时荧光定量检测干扰效率
1、35天长至6-8叶,进行实时荧光定量检测干扰效率
2、实时荧光定量结果显示,基因沉默成功。
3、可进行后续实验
五、注意事项
1、培养农杆菌的条件:28℃、150r、暗培养12h;
2、离心农杆菌:28℃、4500r、10min;
3、OD600=0.8;
4、VIGS侵染液PH=5.0~5.4;
5、混合后的菌液在70转,28度摇3h;
6、选择4叶期、长势一致、健康状况良好的辣椒苗,不可过大,过大则干扰效率不好,叶不能过小,过小则苗容易死亡;
7、将子叶完全打满,如果苗有些过大可注射3-4片真叶;
六、结果分析
七、参考文献
[1]黄鑫,王琪,韦建明,张大龙,曹贺贺,潘寅涛,李云洲.VIGS技术在番茄基因功能中的研究与应用[J/OL].分子植物育种:1-26[2021-11-20].
[2]段郅臻,王童欣,王健.VIGS技术在观赏植物花色研究上的应用[J/OL].分子植物育种:1-16[2021-11-20]
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整体很好,内容全面,文字重点突出,中英文字幕贴心。不足之处是没有解说配音,趣味性可以再增多一些。
操作细菌克隆时琼脂板应倒扣,避免水汽流入克隆。缺乏一些细节说明如离心转速温度等。
内容相对完整,实用价值尚可,创新性不够。
操作与内容完整,但文字描述过得太快。
具有一定的参考价值。
注意事项:操作细菌克隆时琼脂板应倒扣,避免水汽流入克隆。