病毒诱导的基因沉默

一、视频摘要

病毒诱导的基因沉默使用的是烟草脆裂病毒（TRV）介导的基因沉默体系进行辣椒基因沉默实验。在基因的3’非编码区及CDS区分别设计一对目标序列长度在300-400 bp之间的特异性引物，利用引物在辣椒cDNA文库里扩增出特异性目的片段，再通过Gateway技术将特异性片段构建在PYL279（TRV）载体上得到对应基因沉默载体，即:XXX-279,同时利用同样的方法构建阳性对照载体，即：TRV::PDS(八氢番茄红素脱氢酶，此基因沉默引起辣椒叶片的白化现象)，在我们实验室标记为250。本视频系统介绍了病毒诱导的基因沉默的具体操作流程，为茄科作物辣椒的基因沉默提供参考依据。

二、关键词

烟草脆裂病毒；辣椒；病毒诱导的基因沉默

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1.样品信息

辣椒品种选择：HN42

2. 试剂和耗材

1、蛋白胨

2、NaCl

3、酵母

4、KAN

5、RIF

6、MES

7、MgCl₂.6H₂O

8、乙酰丁香酮

9、NaOH

10、去离子水

3.仪器和软件

1、分光光度计

2、恒温培养箱

3、摇床

4、超净工作台

5、PH计

6、冷冻离心机

7、实时荧光定量

四、实验操作

（1）扩增含有目的基因的农杆菌

1、在超净工作台中，将培养基加入到2ml离心管中

2、挑取单克隆到离心管中进行培养

3、分别是 TRVI EMPTY TRV::PDS TRV2-IC

4、将验证过的单克隆进行二次扩增培养

5、扩增好的农杆菌在摇床中黑暗培养

6、28摄氏度 150r  12h

7从摇床中取出培养好的菌液进行离心

8、28摄氏度 4500r  10min

9、离心好的菌液倒掉上清，保留下面沉淀

（2）调整农杆菌OD值

1、用分光光度计调整菌液的浓度

2、菌液的OD600等于0.8

3、将调好的菌液按照1：1等体积混合均匀

4、混合后的菌液放置在摇床中缓慢摇均匀

5、70r  28摄氏度  3h

（3）用侵染液对四叶期辣椒进行高压渗透侵染

1、取出摇好的菌液，进行注射

2、选取四叶期，长势均匀的幼苗

3、用注射器将子叶打满

4、注射好的幼苗在培养箱中进行培养。

5、16摄氏度  56h  黑暗处理

6、处理后的幼苗搬到正常光照处

7、15天左右出现白化苗。

（4）实时荧光定量检测干扰效率

1、35天长至6-8叶，进行实时荧光定量检测干扰效率

2、实时荧光定量结果显示，基因沉默成功。

3、可进行后续实验

五、注意事项

1、培养农杆菌的条件：28℃、150r、暗培养12h；

2、离心农杆菌：28℃、4500r、10min；

3、OD600=0.8；

4、VIGS侵染液PH=5.0~5.4；

5、混合后的菌液在70转，28度摇3h；

6、选择4叶期、长势一致、健康状况良好的辣椒苗，不可过大，过大则干扰效率不好，叶不能过小，过小则苗容易死亡；

7、将子叶完全打满，如果苗有些过大可注射3-4片真叶；

六、结果分析

七、参考文献

[1]黄鑫,王琪,韦建明,张大龙,曹贺贺,潘寅涛,李云洲.VIGS技术在番茄基因功能中的研究与应用[J/OL].分子植物育种:1-26[2021-11-20].

[2]段郅臻,王童欣,王健.VIGS技术在观赏植物花色研究上的应用[J/OL].分子植物育种:1-16[2021-11-20]