根癌农杆菌介导的烟草叶盘法遗传转化

一、视频摘要

遗传转化是基因功能研究中获取植物材料的必要技术手段。根癌农杆菌介导的遗传转化基本原理为根癌农杆菌对植物受伤后释放的化学物质产生趋化反应，向植物受伤组织集中。经共培养后，植物受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。Vir基因产物使Ti质粒上的T-DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中，使外源基因在植物细胞中得到表达。烟草是最早用于遗传转化的模式植物，本视频使用烟草叶盘法，对烟草叶片进行剪切造成伤口，使得根癌农杆菌可以侵染烟草叶片并将外源基因整合到烟草基因组中。

二、关键词

烟草；叶盘法；遗传转化；根癌农杆菌；转基因；组织培养

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

植物材料：苗龄为2个月的烟草无菌苗。

2. 试剂和耗材

（1）农杆菌重悬液：MS培养基粉末（不含琼脂和蔗糖）(青岛高科园海博生物技术有限公司, Cat No./ID: HB8469-5) 4.74 g/L，加入30 g/L蔗糖，调节pH为5.8左右。在悬浮农杆菌前加入乙酰丁香酮（北京索莱宝科技有限公司，Cat No./ID: A8110-1g），终浓度为100 μM。

（2）共培养基：MS培养基粉末 (青岛高科园海博生物技术有限公司, Cat No./ID: HB8469) 41.74 g/L，加热溶解于蒸馏水中，116℃高压灭菌30 min（下同）。倒板前加入6-BA（北京索莱宝科技有限公司，Cat No./ID: A8170-1g）终浓度为1 μg/mL，NAA（北京索莱宝科技有限公司，Cat No./ID: N8010-5g）终浓度为0.1 μg/mL。

（3）S1（分化）培养基：MS培养基粉末41.74 g/L，倒板前加入6-BA终浓度为1 μg/mL， NAA终浓度为0.1 μg/mL，头孢/(噻孢)霉素（北京索莱宝科技有限公司，Cat No./ID: C8240-10g）终浓度为500 μg/mL，相应转基因载体抗性的抗生素。

（4）S2培养基：MS培养基粉末41.74 g/L，6-BA终浓度为0.5 μg/mL，NAA终浓度为0.05 μg/mL，头孢/(噻孢)霉素终浓度为500 μg/mL，相应转基因载体抗性的抗生素。

（5）S3培养基：MS培养基粉末41.74 g/L，6-BA终浓度为0.2 μg/mL，NAA终浓度为0.02 μg/mL，头孢/(噻孢)霉素终浓度为500 μg/mL，相应转基因载体抗性的抗生素。

（6）生根培养基：MS培养基粉末41.74 g/L，不加6-BA，NAA终浓度为0.02 μg/mL，头孢/(噻孢)霉素终浓度为500 μg/mL，相应转基因载体抗性的抗生素。

3. 仪器和软件

HITACHI CENTRIFUGE CR22GⅡ离心机，设置离心参数为：室温，5000 rpm，加速度和减速度为5，时长10 min。

四、实验操作

1. 无菌苗的培养^[1]

（1）烟草种子适量放入1.5 mL离心管中，无菌水泡洗一次（可室内操作），用75%酒精消毒20 s，无菌水清洗3次，然后用15 % H₂O₂浸泡8 min，无菌水清洗3遍，最后加入300 µL蒸馏水，倒在滤纸上晾干。

（2）用灭过菌的牙签点播在1/2 MS培养基上，置于烟草人工气候培养室中培养。待烟苗长至十字期时（播种后大约 3 周）移至装有MS固体培养基的组培瓶中，在烟草人工气候培养室中继续培养 30-45天备用。

2. 烟草的遗传转化^[2]

（1）菌液制备：从-80℃超低温冰箱取出含有目的基因的 EHA105 农杆菌，用灭菌的枪头蘸取少量活化于含有相应抗生素的LB固体培养基上，约48 h长出单菌落。挑取单菌落接种于含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃摇床振荡培养 24 h。取1 mL上述菌液接种于50 mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，继续振荡培养约 6~8 h，至OD₆₀₀值达到 0.6~0.8。

（2）农杆菌重悬（见视频）：将菌液在5000 rpm转速下离心10 min，倒掉上清液，加入适量烟草侵染农杆菌悬浮液，调节OD₆₀₀至0.6~0.8。

（3）侵染（见视频）：在超净工作台中将无菌烟苗叶片剪下，剔去主脉，选择较为平整的叶片部分剪成拇指盖大小的叶盘。期间为了防止叶盘萎蔫，可以加入无菌水保湿。将叶盘倒入农杆菌重悬液中侵染 8~10 min，其间不断摇晃使得叶盘充分接触农杆菌。侵染结束后，用滤纸吸干叶盘表面水分，移入共培养基中，叶盘正面朝下接触共培养基。将培养皿用锡箔纸包好放入25℃烟草培养室中暗培养3 d。

（4）继代培养（见视频）：取出暗培养后的叶片，先用无菌水清洗表面菌体，然后分别用含有1000 μg/mL、500 μg/mL头孢/(噻孢)霉素的无菌水各清洗一次，分别为2 min和1min，再用无菌水清洗三次，将叶盘捞出后用滤纸吸干水分，叶盘正面朝上移入S1培养基中。光照下培养8~10 d后即可看到叶盘周围有愈伤组织出现，之后分化出小芽；培养3周后可将小芽切下移入S2培养基中；在S2培养基中生长1周后可将芽切下移入S3培养基培养基中；在S3培养基中生长1周后可将大芽切下移入生根培养基（愈伤组织要切除干净）；移入生根培养基1周后可看到大芽生根，再生长1周可将生根的烟苗从组培瓶中取出来，清除根部的固体培养基后移入花盆中；用透光性好的罩子罩住保湿，待苗子生长2-3 d 后，移去罩子。

五、注意事项

（1）根癌农杆菌活性要高，因此要认真活化和小摇培养。

（2）剪切叶盘的时候避免萎蔫，加入无菌水保湿。

（3）如果分化的芽生长的缓慢，可以在S1培养阶段增加1-2次转移，使得营养供应充足。

（4）移入生根培养基的大芽上面的愈伤要切除干净，否则影响生根。移入生根培养基中3周以上还没有生根的苗可大致认定为阴性苗，舍弃即可。

（5）不同阶段所用的培养基中的生长素浓度和比例要准确，一般配置1 mg/mL的6-BA母液、0.1 mg/mL的NAA母液、250 mg/mL的头孢/(噻孢)霉素母液、相应转基因载体抗性的抗生素母液、100 mM的乙酰丁香酮母液，倒培养基之前加入相应体积的过滤灭菌后的母液。

（6）刚从组培瓶中移入土中的小苗要罩好罩子，保持水分，保证成活率。

（7）烟草小苗的培养要预防烟草黑茎病，烟草黑茎病致死率高且传染性强，根灌烯酰吗啉（巴斯夫 阿克白）可有效预防。

六、结果分析（可选）

无

七、参考文献（可选）

[1] 董连红. 林烟草CBL基因家族成员NsylCBL10的功能分析[D].北京: 中国农业科学院, 2015.

[2] 毛静静. 林烟草NsylCBL10和NsylCBL5的功能研究[D].北京: 中国农业科学院, 2017.