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完整叶绿体的制备

林文芳 |  2021-12-10  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v889
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视频简介本节短视频讲解完整叶绿体的制备。利用不连续percoll介质梯度离心提取完整叶绿体,是目前常用的公认的制备完整叶绿体的方法,是开展叶绿体相关机制研究的基础和关键实验技能,本实验视频利用动画详细讲解了不同的离心原理,并通过微距拍摄详细演示实验操作过程及注意事项,对要开展相关研究的实验人员具有直观指导意义。
  • 视频介绍
  • 评审评语摘选

一、视频摘要

为了获取纯度高的完整叶绿体用于相关实验,利用通过40%85%percoll作为介质采用不连续密度梯度离心法分离叶绿体。

 

二、关键词

完整叶绿体、percoll、水平离心

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

拟南芥成熟叶片

 

2. 试剂和耗材

1、研磨缓冲液液A

50 mM  HEPES-KOH (pH 8.0)330 mM山梨醇、2 mM EDTA-Na 2 (pH 8.0)5 mM抗坏血酸、5 mM半胱氨酸;0.05%牛血清白蛋白(BSA)

2、清洗缓冲液B

50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)330 mM山梨醇,2 mM EDTA-Na 2 (pH 8.0)

3100% PF-Percoll

0.8 g PEG 8000, 0.27 g Ficoll 400000。加Percoll27.5 mL终体积。

4Percoll梯度

PF Percoll(40%85%)0.5 mM EDTA, 50 mM HEPES- KOH (pH 8.0)330 mM山梨醇。

5、蛋白酶抑制剂PI母液

备注:试剂纯度要求分析纯及以上,品牌无特殊要求

耗材:鉴于后期实验的需要,尽量使用RNase-free或灭绝过的耗材。

 

3. 仪器和软件

组织匀浆器(匀浆)

水平离心机(分离叶绿体)

酶标仪(检测叶绿素浓度)

荧光显微镜(检测叶绿体完整性)

电泳仪、转膜仪等(western blot,用于检测叶绿体提取纯度)

 

四、实验操作

1、试剂和仪器准备:

1)、配置好试剂,灭菌备用。(2)、准备600目尼龙布,孔径约22um,剪成合适的大小,浸渍在研磨缓冲液A中。(3)制作percoll梯度分离液,下层为85%PF-Percoll,上层为40% PF-Percoll

2、取材、匀浆。

1)以成熟未抽薹的莲座叶为材料,冰上取材,避光放置半小时。(2)加入研磨缓冲液A(质量体积比1:10),匀浆,1 1下,匀浆30下。(3)尼龙布过滤。

3、不连续密度梯度离心法分离叶绿体

1)离心管在天平上配平后,离心机内对称放置,4℃下1300g离心3分钟。(2)去上清,加入预冷的清洗缓冲液B,重悬,完全重悬后滴管吸取铺于预制好的PF-percoll介质液上。(34℃下,3750g离心10min。(4)离心后可见明显分层,取4085%的中间层于1.5mL离心管中,即完整叶绿体。(5)加入清洗缓冲液B,轻柔重悬。4℃下,1200g离心3分钟,去除上清液,此步骤重复1遍,至上清液澄清以去除残余percoll。沉淀即完整的叶绿体。(6)加入含有蛋白酶抑制剂PI的清洗缓冲液B,重悬。(7)测定叶绿素浓度,用含有PI的清洗缓冲液B调整叶绿素浓度至1 ~ 3 mg/mL,分装,液氮冻存后存于-80℃。

4、制片,在荧光显微镜下检测叶绿体的完整性。

5、用western blot方法,以叶绿体、细胞核和线粒体特定抗体检测是否有细胞器污染。

 

五、注意事项

1、           认真制作percoll梯度溶液,形成分层,水平离心升速和降速要慢,保证分层不被打破。

2、           为了保证叶绿体的活性,所有的试剂都需要低温预冷。

3、           所有操作在低温环境下完成,操作动作迅速,尽量在1小时内完成。如果有多个样品,建议分批次完成。

 

六、结果分析(可选)

1、样品加载量过大,提取效果不佳。

2、水平离心升速和降速不宜过快,否则percoll界面易被打破,提取效果差。

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该视频较好的讲解了完整叶绿体的分离方法,并对该方法的应用场景进行了描述,实操性强,具有很好的教学效果。
该视频介绍了提取拟南芥叶片的叶绿体的方法,视频完整流畅,从背景原理的动画介绍,到实际动手操作,内容详实,细节到位,完全可以作为一个操作实验的视频演示。
视频内容完整,介绍全面,所有的标签纸打印清晰,操作规范,配音清晰易懂!
虽然不知道是不是真的是将网课的视频拿过来参赛,但是确实讲解的很细致、到位,操作注意事项及细节都展示的很准确,具有较好的实用价值。
完美。

注意事项:视频时间过长了。