完整叶绿体的制备

一、视频摘要

为了获取纯度高的完整叶绿体用于相关实验，利用通过40%和85%percoll作为介质采用不连续密度梯度离心法分离叶绿体。

二、关键词

完整叶绿体、percoll、水平离心

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

拟南芥成熟叶片

2. 试剂和耗材

1、研磨缓冲液液A

（50 mM  HEPES-KOH (pH 8.0)、330 mM山梨醇、2 mM EDTA-Na 2 (pH 8.0)、5 mM抗坏血酸、5 mM半胱氨酸;0.05%牛血清白蛋白(BSA)）

2、清洗缓冲液B

（50 mM HEPES-KOH (pH 8.0)，330 mM山梨醇，2 mM EDTA-Na 2 (pH 8.0)）

3、100% PF-Percoll

0.8 g PEG 8000, 0.27 g Ficoll 400000。加Percoll到27.5 mL终体积。

4、Percoll梯度

PF Percoll(40%或85%)，0.5 mM EDTA, 50 mM HEPES- KOH (pH 8.0)，330 mM山梨醇。

5、蛋白酶抑制剂PI母液

备注：试剂纯度要求分析纯及以上，品牌无特殊要求

耗材：鉴于后期实验的需要，尽量使用RNase-free或灭绝过的耗材。

3. 仪器和软件

组织匀浆器（匀浆）

水平离心机（分离叶绿体）

酶标仪（检测叶绿素浓度）

荧光显微镜（检测叶绿体完整性）

电泳仪、转膜仪等（western blot，用于检测叶绿体提取纯度）

四、实验操作

1、试剂和仪器准备：

（1）、配置好试剂，灭菌备用。（2）、准备600目尼龙布，孔径约22um，剪成合适的大小，浸渍在研磨缓冲液A中。（3）制作percoll梯度分离液，下层为85%PF-Percoll，上层为40% PF-Percoll。

2、取材、匀浆。

（1）以成熟未抽薹的莲座叶为材料，冰上取材，避光放置半小时。（2）加入研磨缓冲液A（质量体积比1:10），匀浆，1秒 1下，匀浆30下。（3）尼龙布过滤。

3、不连续密度梯度离心法分离叶绿体

（1）离心管在天平上配平后，离心机内对称放置，4℃下1300g离心3分钟。（2）去上清，加入预冷的清洗缓冲液B，重悬，完全重悬后滴管吸取铺于预制好的PF-percoll介质液上。（3）4℃下，3750g离心10min。（4）离心后可见明显分层，取40—85%的中间层于1.5mL离心管中，即完整叶绿体。（5）加入清洗缓冲液B，轻柔重悬。4℃下，1200g离心3分钟，去除上清液，此步骤重复1遍，至上清液澄清以去除残余percoll。沉淀即完整的叶绿体。（6）加入含有蛋白酶抑制剂PI的清洗缓冲液B，重悬。（7）测定叶绿素浓度，用含有PI的清洗缓冲液B调整叶绿素浓度至1 ~ 3 mg/mL，分装，液氮冻存后存于-80℃。

4、制片，在荧光显微镜下检测叶绿体的完整性。

5、用western blot方法，以叶绿体、细胞核和线粒体特定抗体检测是否有细胞器污染。

五、注意事项

1、           认真制作percoll梯度溶液，形成分层，水平离心升速和降速要慢，保证分层不被打破。

2、           为了保证叶绿体的活性，所有的试剂都需要低温预冷。

3、           所有操作在低温环境下完成，操作动作迅速，尽量在1小时内完成。如果有多个样品，建议分批次完成。

六、结果分析（可选）

1、样品加载量过大，提取效果不佳。

2、水平离心升速和降速不宜过快，否则percoll界面易被打破，提取效果差。