一、视频摘要
脂肪组织的组成除成熟的脂肪细胞外，还包括前体脂肪细胞，免疫细胞，血管内皮细胞等在内的基质血管成分（Stromal Vascular Fractions ，SVFs）。原代前体脂肪细胞的分离培养可为体外研究脂肪细胞的分化，细胞因子分泌及其功能提供良好的细胞模型，较细胞株可更好反应生理情况下脂肪前体细胞的功能与状态。本视频介绍了原代脂肪细胞分离所需的准备物品，脂肪组织的分离、消化和培养。
二、关键词
脂肪原代细胞；皮下脂肪组织；SVFs分离与培养
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
6只小鼠3-4周龄
2. 试剂和耗材
试剂：HEPES溶液（Gibco,15630-080）；二型胶原酶（Sigma,C6885）；F12/DMEM (Gibco,11320-033)
耗材：0.22um 滤器（Millipore）；50ml 离心管，6cm 培养皿（Corning）；40um 筛网（Falcon）
3. 仪器和软件
显微镜（Leica）
四、实验操作
1.准备工作
1.1 原代分离所需物品准备
提前30分钟在原代分离细胞台紫外下列物品：吸水纸、高压好的器械、注射器、0.22um 滤器、50ml离心管、6cm培养皿、薄膜手套。
1.2 分装PBS，配置胶原酶
细胞房内分装浸泡组织用的无菌PBS；分装PBS配置10mM HEPES溶液（Gibco,15630-080）（1只小鼠1-2ml即可）;在HEPES溶液中加入2mg/ml二型胶原酶（Sigma,C6885）颠倒混匀，使其充分溶解。
1.3 过滤胶原酶，器械准备
原代细胞分离台中将分装的PBS倒入培养皿内备用；0.22um 滤器过滤配好的HEPES-胶原酶溶液备用；打开高压好的器械盒，准备一把剪刀一把镊子用于在体分离脂肪组织用，保证无菌，另准备剪皮用的剪刀镊子。
1.4 小鼠酒精消毒
6只小鼠3-4周龄，颈椎脱臼处死，浸泡于酒精中5-10分钟。注意：小鼠周龄越小，脂肪细胞分化能力越强。取出小鼠于吸水纸上，略吸干酒精备用。
2. 分离小鼠皮下脂肪组织
2.1剪皮，暴露iWAT （inguinal White adipose tissue，皮下脂肪组织）
将小鼠背面朝上放置，切口选择上肢根部连线，剪开皮肤；双手捏住切口上下皮肤，两侧扯开，可以看到对称的腹股沟部位白色脂肪组织。
2.2 悬空分离iWAT
使用准备好的无菌镊子扯下两侧iWAT，注意不要碰到外侧皮肤；将两侧的iWAT浸泡入装有PBS的培养皿内。
2.3 剪碎脂肪组织
使用无菌镊子将分离的iWAT转移至皿盖中；使用无菌剪刀进行剪碎，剪至无大组织块即可；将剪碎的iWAT转移至HEPES-胶原酶溶液，封上封口膜进行下一步消化。
3. 脂肪组织的消化
将离心管封口混匀，倾斜放置于37度水浴锅中；摇晃消化30分钟，期间可每隔10分钟取出涡旋混匀促进消化。见消化至无组织块即可（圆颗粒为淋巴结）。
4. 基质血管成分铺皿（stromal vascular fractions，SVFs）
4.1 终止消化
离心结束可见明显沉淀。
4.2 过40um筛网
弃去上清，加入5mlDMEM进行重悬，过40um筛网；再次4度，2000rpm，离心10分钟。
4.3 SVFs重悬铺皿
离心结束后弃上清，加入F12(Gibco,11320-033)完全培养基重悬，铺到6cm皿内，一般4-6只小鼠铺1个皿，2-3天可以长满；将细胞置于7.5%CO2孵箱进行培养。
5. 洗细胞
5.1 PBS洗细胞
约4h细胞贴壁后，吸弃培液，加入1-2ml PBS，摇晃培养皿进行洗细胞；重复洗3-5次，直至液体澄清。
5.2 镜下观察脂肪原代细胞
五、注意事项
1. 全程无菌操作，小鼠要提前酒精浸泡防止污染。
2. 小鼠皮下脂肪前体细胞随着小鼠周龄增大，诱导分化潜能逐渐下降，故建议选择4周内小鼠进行实验。
4. 剪开皮肤的剪刀需与取材的剪刀相区分，避免污染。
3. 需要的胶原酶量和消化时间需要根据具体情况相应增减。如果消化已经完全，未见明显组织则可停⽌消化。
3. 脂肪原代细胞在低温可保持良好的活力，从消化后均应4度离心。
六、结果分析
镜下观察：贴壁细胞即为原代脂肪细胞。
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七、参考文献
1. Wang, J., Liu, R., Wang, F., Hong, J., Li, X., Chen, M., ... & Ning, G. (2013). Ablation of LGR4 promotes energy expenditure by driving white-to-brown fat switch. Nature cell biology, 15(12), 1455-1463.
2. Chen, M., Lu, P., Ma, Q., Cao, Y., Chen, N., Li, W., ... & Wang, J. (2020). CTNNB1/β-catenin dysfunction contributes to adiposity by regulating the cross-talk of mature adipocytes and preadipocytes. Science advances, 6(2), eaax9605.
3. Liu, W., Li, D., Yang, M., Wang, L., Xu, Y., Chen, N., ... & Wang, J. (2022). GREM2 is associated with human central obesity and inhibits visceral preadipocyte browning. EBioMedicine, 78, 103969.
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