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小鼠原代脂肪细胞的分离培养

陈纳 |  2021-12-10  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v915
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视频简介脂肪细胞在生物体能量的储存与平衡中发挥至关重要的作用。脂肪组织的组成除成熟的脂肪细胞外,还包括前体脂肪细胞,免疫细胞,血管内皮细胞等在内的基质血管成分(Stromal Vascular Fractions ,SVFs)。原代前体脂肪细胞的分离培养可为体外研究脂肪细胞的分化,细胞因子分泌及其功能提供良好的细胞模型,较细胞株可更好反应生理情况下脂肪前体细胞的功能与状态。本视频介绍了原代脂肪细胞分离所需的准备物品,脂肪组织的分离、消化和SVFs培养。首先是在原代分离细胞台提前30分钟对所需要的物品进行紫外,同时进行胶原酶的配置及小鼠酒精浸泡消毒。然后选择小鼠上肢根部连线为切口,撕开皮肤暴露腹股沟皮下脂肪组织,进行在体分离,并迅速将脂肪组织浸泡在PBS保持细胞活性,该过程注意无碰到小鼠外皮。分离完所有小鼠后,对脂肪组织进行剪碎,消化30分钟,至无明显组织块。终止消化后,通过离心,过筛网,再次离心,即可得到SVFs细胞。铺皿后约4h进行洗细胞,贴壁细胞即为原代脂肪细胞。
  • 视频介绍
  • 评审评语摘选

一、视频摘要

脂肪组织的组成除成熟的脂肪细胞外,还包括前体脂肪细胞,免疫细胞,血管内皮细胞等在内的基质血管成分(Stromal Vascular Fractions SVFs)。原代前体脂肪细胞的分离培养可为体外研究脂肪细胞的分化,细胞因子分泌及其功能提供良好的细胞模型,较细胞株可更好反应生理情况下脂肪前体细胞的功能与状态。本视频介绍了原代脂肪细胞分离所需的准备物品,脂肪组织的分离、消化和培养。

 

二、关键词

脂肪原代细胞;皮下脂肪组织;SVFs分离与培养

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

6只小鼠3-4周龄

 

2. 试剂和耗材

试剂:HEPES溶液(Gibco,15630-080);二型胶原酶(Sigma,C6885);F12/DMEM (Gibco,11320-033)

耗材:0.22um 滤器(Millipore);50ml 离心管,6cm 培养皿(Corning);40um 筛网(Falcon

 

3. 仪器和软件

显微镜(Leica

 

四、实验操作

1.准备工作

1.1 原代分离所需物品准备

提前30分钟在原代分离细胞台紫外下列物品:吸水纸、高压好的器械、注射器、0.22um 滤器、50ml离心管、6cm培养皿、薄膜手套。

1.2 分装PBS,配置胶原酶

细胞房内分装浸泡组织用的无菌PBS;分装PBS配置10mM HEPES溶液(Gibco,15630-080)(1只小鼠1-2ml即可);HEPES溶液中加入2mg/ml二型胶原酶(Sigma,C6885)颠倒混匀,使其充分溶解。

1.3 过滤胶原酶,器械准备

原代细胞分离台中将分装的PBS倒入培养皿内备用;0.22um 滤器过滤配好的HEPES-胶原酶溶液备用;打开高压好的器械盒,准备一把剪刀一把镊子用于在体分离脂肪组织用,保证无菌,另准备剪皮用的剪刀镊子。

1.4 小鼠酒精消毒

6只小鼠3-4周龄,颈椎脱臼处死,浸泡于酒精中5-10分钟。注意:小鼠周龄越小,脂肪细胞分化能力越强。取出小鼠于吸水纸上,略吸干酒精备用。

 

2. 分离小鼠皮下脂肪组织

2.1剪皮,暴露iWAT inguinal White adipose tissue,皮下脂肪组织)

将小鼠背面朝上放置,切口选择上肢根部连线,剪开皮肤;双手捏住切口上下皮肤,两侧扯开,可以看到对称的腹股沟部位白色脂肪组织。

2.2 悬空分离iWAT

使用准备好的无菌镊子扯下两侧iWAT,注意不要碰到外侧皮肤;将两侧的iWAT浸泡入装有PBS的培养皿内。

2.3 剪碎脂肪组织

使用无菌镊子将分离的iWAT转移至皿盖中;使用无菌剪刀进行剪碎,剪至无大组织块即可;将剪碎的iWAT转移至HEPES-胶原酶溶液,封上封口膜进行下一步消化。

 

3. 脂肪组织的消化

将离心管封口混匀,倾斜放置于37度水浴锅中;摇晃消化30分钟,期间可每隔10分钟取出涡旋混匀促进消化。见消化至无组织块即可(圆颗粒为淋巴结)。

 

4. 基质血管成分铺皿(stromal vascular fractionsSVFs

4.1 终止消化

离心结束可见明显沉淀。

4.2 40um筛网

弃去上清,加入5mlDMEM进行重悬,过40um筛网;再次4度,2000rpm,离心10分钟。

4.3 SVFs重悬铺皿

离心结束后弃上清,加入F12(Gibco,11320-033)完全培养基重悬,铺到6cm皿内,一般4-6只小鼠铺1个皿,2-3天可以长满;将细胞置于7.5%CO2孵箱进行培养。

 

5. 洗细胞

5.1 PBS洗细胞

4h细胞贴壁后,吸弃培液,加入1-2ml PBS,摇晃培养皿进行洗细胞;重复洗3-5次,直至液体澄清。

5.2 镜下观察脂肪原代细胞

 

五、注意事项

1. 全程无菌操作,小鼠要提前酒精浸泡防止污染。

2. 小鼠皮下脂肪前体细胞随着小鼠周龄增大,诱导分化潜能逐渐下降,故建议选择4周内小鼠进行实验。

4. 剪开皮肤的剪刀需与取材的剪刀相区分,避免污染。

3. 需要的胶原酶量和消化时间需要根据具体情况相应增减。如果消化已经完全,未见明显组织则可停消化。

3. 脂肪原代细胞在低温可保持良好的活力,从消化后均应4度离心。

 

六、结果分析

镜下观察:贴壁细胞即为原代脂肪细胞。

40x 

 

七、参考文献

1. Wang, J., Liu, R., Wang, F., Hong, J., Li, X., Chen, M., ... & Ning, G. (2013). Ablation of LGR4 promotes energy expenditure by driving white-to-brown fat switch. Nature cell biology15(12), 1455-1463.

2. Chen, M., Lu, P., Ma, Q., Cao, Y., Chen, N., Li, W., ... & Wang, J. (2020). CTNNB1/β-catenin dysfunction contributes to adiposity by regulating the cross-talk of mature adipocytes and preadipocytes. Science advances6(2), eaax9605.

3. Liu, W., Li, D., Yang, M., Wang, L., Xu, Y., Chen, N., ... & Wang, J. (2022). GREM2 is associated with human central obesity and inhibits visceral preadipocyte browning. EBioMedicine78, 103969.

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整体很好,解说清晰,步骤明确,可适当增加趣味性。
实验操作步骤清晰,如加入脂肪细胞的定性会更好。
内容完整、文字准确、操作规范、实用性强,但创新性不够。
视频制作精美,讲解详细。
具有一定的实用价值。有些文字错误和不规范,度、um等,没有背景音乐。

注意事项:有些文字错误和单位不规范,度、um等,分钟写法不同,离心不应该用的rpm,应改为× g