Leica DMi8 Infinity TRIF显微系统基本操作介绍

一、视频摘要

本实验介绍了Leica DMi8 Infinity TRIF显微系统观察实验样品的主要步骤，包括明场、荧光场的操作流程，以及使用TIRF功能所需要做的校准操作和观察样品所需要的操作，为不熟悉该仪器的研究人员提供了简单的操作流程规范参考。

二、关键词

Leica DMi8，Standard operation protocol，操作流程，使用规范

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

转入荧光蛋白的Zymomonas mobilis ZM4。

2. 试剂和耗材

世泰病理级蒙砂超白载玻片，世泰超白玻璃盖玻片，10 μL通用移液枪头。

3. 仪器和软件

仪器：Leica DMi8 Infinity TRIF 及配套图形工作站

软件：LAS X

四、实验操作

整体操作步骤：

1.     硬件启动

以下步骤按顺序进行

o  电脑电源打开

o  控制箱开关打开

o  摄像头开关打开

o  激光控制箱开关打开（若需要看荧光）

如须使用TIRF，请增加下面一步操作

n  TIRF 激光控制箱开关打开，钥匙旋转至ON

2.     软件启动

以下步骤按顺序进行

o  双击LAS X打开软件，等待加载

o  在配置步骤不做任何操作，直接点击OK或等待倒计时结束，等待程序加载

o  在电子载物台初始化步骤根据需要选择：

若需要使用多点自动拍摄，则选择Yes，注意此时载物台不要有任何物体！

若仅手动拍摄，则点击No进入下一步

o  根据需要选择配置文件或自己进行设置

3.     寻找物象

o  将样品置于载物台上，选择10倍镜，调节载物台使得样品所在位置处于物镜视野中央

o  在显微镜操作菜单上切换光路到目镜，保持TL-shutter打开将物镜位置调整到预设焦平面上

o  使用Z轴控制旋钮找到样品，找到后逐步切换到高倍镜

注：切换到63倍镜时要取下样品，切换到63倍镜后滴加纯水后再放置样品重新对焦；100倍镜同样操作，请滴加徕卡配套的物镜油！

o  找到物象后在显微镜操作菜单上切换光路到摄像头，准备在电脑上拍摄。

4.     关机顺序

o  关闭软件

o  关闭所有激光控制箱

o  关闭摄像头

o  关闭控制箱

o  电脑关机

o  确认所有设备已关闭并盖上防尘罩

采图操作步骤:

1.      目镜下定位样品

此步骤是在显微镜目镜下找好视野并调好焦距

将样品（盖玻片朝下）放在样片夹上，取放样品时推放显微镜立柱红圈圈出部位。

先用低倍物镜找到视野及焦距。(如果需要使用油镜，使用徕卡配套镜油)。

显微镜触摸屏操作简介：

在显微镜触摸屏上点击切换为明场BF或者荧光模式FLUO（选择对应滤色块，如DAPI等）寻找样品：

选择DIC作为观察方式，点亮TL-shutter，直接在显微镜下寻找视野调节好焦距。在触摸屏上通过intensity调节光强，或者显微镜左侧小黑旋钮调节。

选择FLUO（荧光）作为观察方式，根据样品标记情况选择适合的滤色块，点亮IL-shutter，在显微镜下寻找视野调节好焦距。在触摸屏上通过FIM调节光强，或者显微镜左侧小黑旋钮调节。

（显微镜图标下最下面一排平时不动）

物镜的切换可以在显微镜触摸屏也可以在软件进行。

在干镜、水镜、油镜间进行切换时一定要先把玻片和物镜上的油或水擦净，之后再切换。油镜使用配套镜油，水镜使用新鲜蒸馏水。使用完后，油镜用擦镜纸擦去油再用擦镜纸沾湿无水乙醇清洁，水镜使用擦镜纸擦净。

63倍镜为水镜。100倍物镜为油镜，分辨率高，TIRF专用物镜。

2.      采图设置

如需要拍明场图选择TL-BF，伪彩选择灰色。

如需要拍荧光图，选择FLUO，选择好对应滤色块（QWF-T为TIRF滤色块），荧光图像原始数据为灰度图，可以双击从LUT (色彩查找表)中选择对应的颜色 。

如果为多色实验则通过点击 + 图标来添加，每添加一个通道选择好对应滤色块、伪彩。也可以点击 – 图标删除不需要的通道。

在界面左侧Acquisition设置采集相关参数：

Image Format 选择No Binning，也可以选择2*2 binning来提高灵敏度，特别是荧光信号弱时。

Binning 是将几个像素加起来作为一个像素读出以提高灵敏度。比如Binning 2x2就是4个像素联合起来 (x方向2个像素*y方向2个像素)。

Exposure：明场图像一般5-20ms的曝光时间即可，荧光几十毫秒到几百毫秒（基本上也不用超过500ms）。可以对每个通道的曝光时间分别设置。如果图像不亮可以调节对比度。

 

! 注意! 减少曝光时间可以保护标本，提高采图速度。

当进行多通道采图时，每个通道曝光时间/荧光光强可以各自优化，但是Binning是统一的。

Autoscale可以选中图像左上角的第二个图标，一般对比度亮度有500~1000就可以了（12bit时）。

变成红色A就是变成了AutoScale

点击左下角Live键来预览图像，调节好视野、焦距以及曝光时间，至达到想要的图像效果，再切换到下一个通道。每个通道都调节好之后，点击软件中间最下面的Start进行图像采集。

Single Image是采集当前正在预览通道的图像，Capture Image是采集已添加的所有通道的图像。

3.      数据保存

实验做完后，保存需要的图像。选中需要保存的project右键save as（或者点第四个保存图标保存所有Project），格式为leica image file，保存好后文件后缀为lif，该文件包含所有采图信息。之后可以open该文件夹选中对应图像点击apply图标应用该图像的光路设置。

徕卡离线版软件可以打开该文件进行导图及定量分析。

4.      关机顺序

保存好数据之后即可关闭软件，如果使用过油镜需要用擦镜纸沾湿无水乙醇清洁。在显微镜触摸屏上将物镜切换到最低倍物镜，通过调焦旋钮降低载物台。依次关闭荧光光源控制箱、摄像头、显微镜控制箱、电脑。如果使用TIRF需要关掉激光器控制箱 “LASER”按钮，将“Emission”上的激光钥匙旋至“OFF”。

5.      其它高级操作

u  时间序列采图：

在 “Acquisition”中选中t，将出现 xyt 扫描菜单，可进行时间序列图像采集的设置。

Time Interval（采集相邻两帧图像的时间间隔）可以在输入框中定义（定义的时间间隔大于 Minimize 值）。

如果 Minimize 被激活了，则图像采集时会按照最短时间间隔来执行。

选择 Acquire until Stopped 则实验没有明确的结束时间，图像将持续采集直至点击 stop 来终止。

选择 Duration，可定义采图总时间，最常用。

选择 frames 则可定义所需的图像采集帧数

设置好后，点击 Start 开始图像采集。

u  三维图像 z-stack 的获取：
设置好光路、找好视野和焦距之后，如需做三维图像，选中Z，。在界面左侧下方有 z-stack。

设置好后，点击 Start 开始图像采集。

u  视野拼图 LAS X Navigator：

设置好各通道条件，点击拼图图标 ，进入 Navigator 界面。一般拼图实验建议先用低倍物镜进行预扫快速确定拼图范围。

软件界面左侧上方 preview 为预览的数据，下方 task list 为任务栏，需要正式拼图的 task 前打上勾即可。设置好后，点击 Start 图标开始图像采集。

采图完成后 project 里面，tilescan后缀为xys的即为原始未拼接数据。带merged为拼图数据

TIRF全内反射显微成像

开机时需要再按“LASER”按钮，将“Emission”上的激光钥匙旋至“ON”。

使用100倍TIRF专用物镜，为油镜。可以先用FLUO模式找到视野和焦距。

1、校准：不同样品由于液体折射率差异，经常需要校准。

488，功率通常不超过20%。

点击左侧控制台区的Auto align，开始校准。

注意，校准时要将TIRF校准模块推到光路中。

点击Enable Collimator，通过调节XYZ使亮点到中心位置，点击Align and Save。

校准结束后将模块推回。

2、TIRF采图设置

如GFP选择488，功率通常不超过20%。通过选择90/110/130/150/200/250来确定穿透深度，EPI指荧光显微镜模式。根据样品实际情况调节方位角0~360度。

五、注意事项

1)   严格遵守开关机顺序。

2)   荧光光源的开关间隔必须在30分钟以上，即关闭荧光光源后建议不要马上开启，需等待30分钟。

3)   开机初始化过程中，载物台会向四周运动因此需保证周围没有物品阻碍其运动。

4)   采集图像时，应避免震动、环境光线等的干扰。

5)   若需要从油镜切换到其他物镜，要先用擦镜纸擦去油镜和样品上的油，再切换。确保不会污染其他物镜。

6)   油镜使用专用镜油。 水镜使用新鲜蒸馏水。

7)   关机前，尽量将物镜转换为低倍并调至低位可最大程度保护物镜。

8)   室内环境温度尽量保持恒定，范围为 18 -25 ℃。相对湿度 20-60%，房间注意防尘、防潮。

9)   避免空调直接对着显微镜吹风。