一、视频摘要
在微生物学研究中，经常会遇到种属鉴定的问题。除传统的形态学鉴定之外，微生物的系统学鉴定也是必不可少的研究内容；通过基于16S rRNA基因的系统进化分析，能够快速准确地确定未知微生物的分类学地位，从而为后续研究提供必要的前提条件。本视频从测序结果的选择，序列的在线比对，系统进化树的构建，以及进化树的编辑和美化等角度全方位介绍，为初学者提供了详细准确的分析方法。本视频涉及到的方法不仅适用于微生物学领域，同样适用于植物系统学，动物系统学等领域进化树的构建。
二、关键词
16S rRNA基因，系统进化树，微生物，菌种鉴定
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
由测序公司产生的格式为ab1的文件
2. 试剂和耗材
无
3. 仪器和软件
MEAG 11，EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/))
四、实验操作
一、测序结果的选择
1、选取测序结果中格式为 ab1 的文件并用 MEGA 7.0 软件打开；
2、每个碱基位对应单一且明显的特征峰即为测序结果可靠。
二、序列在线比对
1、确定测序结果可靠之后，将其保存为 FASTA 格式的文件并粘贴到 EzBioCloud数据库进行比对 (https://www.ezbiocloud.net/)，选择“16S-based ID” ；
2、打开页面后点击“Identify new sequence”，在相应的位置输入序列信息，然后点击“Next”进行比对；
3、从比对结果可以查看菌株的分类地位，最相似菌株，序列完整性等信息，点击
可查看详细的比对信息；
4、选择正式发表的“Valid names only”菌株信息。然后将比对结果以“FASTA”文件的形式保存在本地。
三、系统进化树的构建
1、打开 MEGA，点击“File”选项并选择“Open a File”，打开上一步从EzBioCloud 下载的 FASTA 文件；
2、选择“Align”并点击“W”图标，进一步选择“Align DNA”进行序列多重比对；
3、直接点击“OK”进入下一步，比对完成后删除序列前后两端长度不一致的序列，保留带有“*”部分的序列，依次点击“Data”和“Save as”或者直接点击键盘“Ctrl+S”键，将其保存为 masx 格式的文件；
4、回到 MEGA 主页，点击“Phylogeny”并选择“N-J”树进行系统发育树的构建，在对话框中打开上一步保存的MASX 格式文件，设定并保存相应参数，注意 Bootstrap 重复次数为 1000 次，点击“Compute”运行软件；
5、软件运行完成后直接生成系统发育树，此时可将系统树“Copy to Clipboard”并粘贴到 PPT 中
进行字体和颜色调整，也可点击“File”直接保存为 PDF 格式文件。
四、系统进化树的编辑和美化
1、系统进化树的美化可直接在MEGA中进行；
2、点击工具标志的 “Option”对进化树标记和美化，通过“Labels”对每一个进化枝设定不同的形状和颜色标记：
a: 在“Tree”下可以将进化树设置成环状或者辐射状
b: 在“Branch”下可以对进化树的线条粗细进行编辑
c: 在“Cutoff”下可自定义进化树的自聚值显示，如50%，75%，90%
3、整理和美化之后的进化树如下图所示：
五、注意事项
构建系统进化树时运行参数的选择：Bootstrap重复次数为1000次，
六、结果分析
根据系统进化枝的长度和进化树上的位置确定目标菌株和相应类群的进化距离。
七、参考文献
[1] Koichiro T , Glen S , Sudhir K . MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11[J]. Molecular Biology and Evolution, 2021,38(7):2022-3027. doi: 10.1093/molbev/msab120
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