一、视频摘要
在肌肉组织中，合成和降解的过程是平衡的，肌肉蛋白[1]不断更新。肌肉功能丧失对人类健康有重大影响，因为它可能导致生活质量下降，发病率增加和死亡率。在人类中，肌肉力量下降是发生几种慢性疾病和死亡风险的最佳预测指标。[2]事实上，肌肉萎缩和虚弱发生在几种全身性疾病中，如饥饿，衰老肌肉减少症，线粒体肌病和癌症恶病。[3]蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成成分，是人体组织更新和修补的主要原料。一些生理活性物质如胺类、神经递质、多肽类激素、抗体、酶、核蛋白以及细胞膜上、血液中用作载体的蛋白质。蛋白质的合成是通过细胞中酶的作用将DNA中所隐藏的信息转录到mRNA中，再由tRNA将相应的氨基酸运到核糖体，形成多肽链，在进行盘曲和折叠形成有活性的蛋白质。所以肌肉中的蛋白质含量对于健康来说有重大的作用。蛋白质是调节机体生理水平的重要指标，因此蛋白质在病理研究中起着至关重要的作用，同时蛋白质对于临床和学术研究也有重大意义。Western Blot是运用免疫学的方法能对蛋白质进行定性和定量分析的一项重要技术，所以运用Western Blot的技术不仅对临床应用有重要意义，而且同时也能为学术研究提供更有效的信息。
二、关键词
免疫印迹，SDS-PAGE，蛋白定量
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
材料
1.5mlEP管(康宁生命科学有限公司)；15mlEP管(康宁生命科学有限公司)；50mlEP管(康宁生命科学有限公司)；1000ml量筒；200ml量筒；100ml量筒；10ml量筒；研磨珠、1000ul移液枪（Eppendorf）；200ul移液枪（Eppendorf）、100ul移液枪（Eppendorf）；20ul移液枪（Eppendorf）；10ul移液枪（Eppendorf）；2.5ul移液枪（Eppendorf）；镊子；剪刀；药匙；计时器；制胶玻璃板（BIO-RAD）；梳子（BIO-RAD）；PVDF膜；避光的黑盒子；孵育盒
试剂
裂解液(Coolabere SL1020);PMSF(Coolabere);PBS（Monad RP050025）;BCA试剂盒(TaKaRa T9300A)、5×loading buffer（碧云天）、脱脂奶粉（BIO-RAD 170-6404）、半干转膜液（BIO-RAD 10026938）;无水乙醇(沪试)甲醇(沪试 YC-SJ06009)、纯水、SDS（Monad CR05201M）;SDS凝胶试剂盒（BIO-RAD 1610173）；10%APS
（MACKLIN A801034）;TEMED;TBST（Monad CR10301M）;一抗（Thermo Scientific）;二抗(Abcam);显色液（Monad 00006238）
仪器设备
冷冻离心机（Eppendorf AG 540CP51361）、电子天平、加样器（Monad IG0411）、电子天平(SHIMADZU)、匀浆仪（Bertin Technologies 02520-300-RD000）、水浴锅(特贴牌 KW1000DA)、酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）、电泳仪（BIO-RAD）、转膜仪(BIO-RAD)、化学发光成像系统（BIO-RAD 721BR10104）;摇床（QILINBEIER KB-700）
四、实验操作
一、样品的准备
1.提前拿出蛋白裂解液解冻，打好冰盒，准备好一组2ml EP管做好标记，准备好提取蛋白需要的试剂与工具。
2.取肌肉组织0.1g，加入1ml裂解液（每0.1g组织加1ml裂解液），加入10ul蛋白酶抑制剂（裂解液：蛋白酶抑制剂=100:1），加入6-7颗研磨珠，封口准备匀浆；
3.将样品放入珠式研磨机中匀浆，匀浆程序为8000rpm/min，3X15s，间隔10s；
4.样品在冰上放置30分钟，使组织中的细胞裂解更完全；
5.放入低温高速离心机内离心，4°C，12000rpm/min，15min；
6.取400ul上清液到1.5ml EP管中。
7.取10ul蛋白用PBS稀释十倍备用，离心混匀；
8.配置BCA工作液，A液：B液=100:1（TaKaRa T9300A）；
9.取96孔酶标板，每孔添加200ul工作液和25ul样品，最后一组需加PBS作为空白对照；
10.将酶标板盖上盖子，放入水浴锅中37°C水浴30分钟；
11.30分钟后，使用酶标仪在562nm处测OD值；
12.将测得的OD值带入BCA标准曲线计算出蛋白浓度，将浓度最小的数值作为统一浓度，算得一个蛋白和裂解液共100ul的上样体系，在该体系中加入25ul5X蛋白上样缓冲液（5X loading buffer），用手指轻弹PCR管混匀；
13.将装有上样体系的200ulPCR管放入水浴锅中95-100°C变性10分钟，变性后所得样品即可用于SDS- PAGE凝胶电泳。
二、SDS-PAGE凝胶电泳
1.每块胶准备一长一短两块玻璃板，用水清洗并晾干，在胶架上安装玻璃板，加纯水检查是否漏液五分钟，若胶板不漏液，将纯水倒掉后加入无水乙醇，等候几秒后倒掉，可用滤纸吸干在玻璃板边缘的水分，等待晾干；
2.根据说明书所给比例配置与目的蛋白质量大小合适浓度的分离胶，轻轻混匀，用1ml移液枪紧贴短玻璃板角落加入，一直加到液面距绿色边框下1cm处或与绿色边框平行；
3.加入1ml甲醇液封压线，放置20-40min，直至甲醇下方出现明显分界线，轻轻晃动胶架，只有甲醇晃动，说明分离胶凝固；
4.倒掉甲醇，根据说明书配置相应浓度的浓缩胶，轻轻混匀，加满胶槽；
5.插入与玻璃板尺寸匹配的梳子，放置30-60min，直至胶凝固；
6.把胶安装好装入电泳槽（短玻璃板朝内，若只有一块胶，另一面用塑料板固定），两块胶之间加满SDS电泳缓冲液，如有漏液需重新安装；
7.上样，Marker5-8ul，样品上样20ug左右；
8.开始跑胶，浓缩胶部分80V，待样品跑到分离胶处被压成一条直线时改变电压至120V；
9.样品跑到玻璃板下端前停止电泳。
三、Western Blot
1.在跑胶过程中，配置好半干转膜液（纯水：无水乙醇：5XTransfer Buffer=3:1:1）和封闭液（脱脂奶粉1.5g+TBST30ml）；
2.提前把两块白色厚滤纸泡在转膜液中，另取一个小槽，倒入少许转膜液备用；
3.电泳结束后，拿出带胶的玻璃板放置在桌面上，用工具轻轻撬开玻璃板，根据Marker确定好目的蛋白位置，切去多余的胶，切完胶后放入准备好的转膜液中平衡10分钟；
4.剪梳子大小的PVDF膜，可剪去左上角或右上角以区分正反面；
5.把PVDF膜放入放入甲醇中醒膜10s；
6.准备转膜板，先用镊子将一块滤纸铺在转膜板中央，再用镊子将膜铺在厚滤纸上（注意正反面，不能有气泡，用转膜液保持湿润），在膜上铺上胶，最后用镊子铺上另一块厚滤纸，铺好后用管子按压赶走多余的液体和气泡，注意不要移动膜内结构，赶出的液体用纸巾擦干，最后盖上盖子，放入转膜仪转膜；
7.转膜完成后，将膜放入封闭液中，放到摇床上封闭1-2小时；
8.按照说明书以最适比例配置一抗；
9.封闭后回收封闭液，膜用TBST漂洗一下，将膜和一抗放入孵育盒中孵育一抗，放置在4°C冰箱中过夜；
10.孵育完一抗，取出膜，用TBST洗3次，每次5-10min；
11.按说明书配置二抗，用TBST洗完后，放入孵育盒中孵育二抗，摇床2-4小时；
12.孵完二抗，取出膜，用TBST洗3次，每次5-10min；
13.在避光环境下配置发光液，用锡箔纸包住1.5ml EP管，加入A液：B液=1:1；
14.用枪头将发光液均匀滴在膜上，盖好盖子，避光1-2min；
15.将膜放入蛋白印迹凝胶成像系统，将遮光片调整至“无遮光片”，选择—印迹—cheim—手动曝光15/30/45/60s，—不要高亮显示饱和像素—放置凝胶—运行；
16.拍Marker，将遮光片调整至“遮光片1”，印迹—Strian Free Gel—自动曝光—防止凝胶—运行；
17.将两张图合并后保存，分析结果。
五、注意事项
1. 在蛋白定量那一步对样品进行适当的稀释；
2. 封闭的时间不宜过长也不能过短，时间过长会使背景太亮，时间短封闭不完全；
3. 二抗的选择要根据一抗的来源选择；
4. 配置显色液和将显色液加在膜上时需要在避光的环境下进行；
5. PVDF膜是疏水性的，所以膜必须首先在甲醇中完全浸湿；
6. 灌胶时尽量均匀不要有气泡；
7. 配胶时要根据目的蛋白的分子量选择胶的浓度；
8. 在实验前确定目的蛋白的分子量的大小，以便切胶时找准位置。
9. 在转膜时要注意将将胶铺平避免气泡产生。
六、结果分析
使用ImageJ软件对结果进行分析
1. 打开图片：File-open
2. 转化为灰度图片：image-type-8-bit
3. 去除背景：process-subtract background选择50
4. 设置参数：analyze-set measurements选择面积area，平均密度mean gray value，灰密度
5. 设置定量单位：analyze-set scale设为pixel
6. 圈中条带：analyze-gels-select first lane
7. 分析圈中条带：analyze-gels-plot lanes
8. 得到结果:选中直线工具，将开口的峰封闭；选中魔棒工具，点击封闭的峰即可显示该峰的面积，及为蛋白条带的灰度值
七、参考文献
1.Léger B, Cartoni R, Praz M, Lamon S, Dériaz O, Crettenand A et al (2006) Akt signalling through GSK-3beta, mTOR and Foxo1 is involved in human skeletal muscle hypertrophy and atrophy. J Physiol 576(Pt 3):923–933.
2. Volaklis KA, Halle M, Meisinger C. Muscular strength as a strong predictor of mortality: a narrative review. Eur J Intern Med 2015;26:303–310.
3. Romanello V, Sandri M. Mitochondrial quality control and muscle mass maintenance. Front Physiol 2015;6:422.
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