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大鼠肠道及膀胱组织全层铺片制备方法

谌婉钰张瑶 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v998
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视频简介免疫荧光是一项基础的实验技术,但它需要一定的技术和方法,本视频将带大家学习初步组织制备的标准操作流程。 本方案描述了一种简单而快速的方法制备大鼠结肠和膀胱不同层的完整标本。小鼠同样适用
  • 视频介绍

一、视频摘要

免疫荧光是一项基础实验,但是它对组织制备的技术要求很高,本方案描述了一种制备大鼠结肠和膀胱组织全层铺片的简便方法,该方法能够轻松分离肌肉层和黏膜层,有助于对组织铺片进行免疫荧光组织化学染色,可以清楚地看到肠道、膀胱肌层的神经节、神经纤维和黏膜层的不同细胞类型。

二、关键词

结肠,膀胱,肌层,全层铺片,免疫荧光

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

实验动物: SPF 级大鼠结肠、膀胱组织

2. 试剂和耗材


3. 仪器和软件



四、实验操作

  1. Kreb’s 液的配制:各成分的浓度分别为:NaCl, 120 mmol/L; KCl, 5.9 mmol/L; NaHCO3, 25 mmol/L; Na2HPO4·12H2O, 1.2 mmol/L; MgCl2·6H2O, 1.2 mmol/L; CaCl2, 2.5 mmol/L; C6H12O6, 11.5 mmol/L。 提前称取以上试剂备用,可具体分为:试剂 A7.013g NaCl0.44g KCl0.244g MgCl2·6H2O; 试剂 B2.1g NaHCO30.43g Na2HPO4·12H2O; 试剂 C0.277g CaCl2; D2.072g C6H12O6。配制时,将 AB 试剂溶解在装有 800ml 纯水的量筒中,将 试剂 C 单独溶解在装有 100ml 纯水的烧杯中制备成母液 C,将母液 C 缓慢加入量 筒中,并用玻璃棒搅拌,使液体澄清。最后加入试剂 D,加纯水定容至 1000ml。 将液体移至蓝口瓶中,置于冰上,通混合氧(95%O25%CO230min 以上。

  2. 300g/L 蔗糖溶液:称取蔗糖 9g,用 1× PBS 溶解定容至 30ml

  3. TPBS 溶液(含 0.05%吐温 20 1×PBS 缓冲液):取 50μl 吐温 20 100ml 1×PBS 中,涡旋混匀,4℃避光保存。

  4. 5%BSA/0.3% Triton X-100/1×PBS:称取 BSA 0.5g,加入 10ml 1×PBS 涡旋 溶解后,加入 30μlTriton X-100 涡旋混匀。

  5. 肌间神经丛、黏膜层全层铺片制备
    1)
    颈椎脱臼法处死大鼠,打开腹腔,迅速取出结肠、膀胱置于 Kreb’s 溶液中。
    2)
    将肠截成小段,用去针头的注射器快速冲洗结肠内部残余粪便;将膀胱置于体式显微镜下,针头固定。
    3)
    将肠段固定于玻璃棒上,除去肠管周围结缔组织,用镊子沿肠系膜附着处轻刮出一条纵向裂隙,使用 Kreb’s 溶液润湿的棉签轻轻地拉开纵行肌(从裂隙的顶部开始),围绕肠管缓慢分离(将肠端反过来套在玻璃棒上,重复以上操作,分离黏膜层);膀胱使用显微镊从一角慢慢分离。
    4)
    将分离的的肌间神经丛面朝上,置于载玻片上。
    5)
    置于 4℃4%多聚甲醛溶液中固定 4-6h 后,1×PBS 洗净。
    6)
    置于 4℃300g/L 蔗糖溶液中过夜,1×PBS 洗净。
    7)
    将铺片用刀片切成 10mm×10mm 小块。

五、注意事项

以上实验步骤组织始终处于通着低流量混合氧的 Kreb’s 溶液中,且在冰上进行。




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