大鼠肠道及膀胱组织全层铺片制备方法

一、视频摘要

免疫荧光是一项基础实验，但是它对组织制备的技术要求很高，本方案描述了一种制备大鼠结肠和膀胱组织全层铺片的简便方法，该方法能够轻松分离肌肉层和黏膜层，有助于对组织铺片进行免疫荧光组织化学染色，可以清楚地看到肠道、膀胱肌层的神经节、神经纤维和黏膜层的不同细胞类型。

二、关键词

结肠，膀胱，肌层，全层铺片，免疫荧光

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

实验动物: SPF 级大鼠结肠、膀胱组织

2. 试剂和耗材

3. 仪器和软件

四、实验操作

1. Kreb’s 液的配制：各成分的浓度分别为：NaCl, 120 mmol/L; KCl, 5.9 mmol/L; NaHCO3, 25 mmol/L; Na2HPO4·12H2O, 1.2 mmol/L; MgCl2·6H2O, 1.2 mmol/L; CaCl2, 2.5 mmol/L; C6H12O6, 11.5 mmol/L。 提前称取以上试剂备用，可具体分为：试剂 A：7.013g NaCl，0.44g KCl，0.244g MgCl2·6H2O; 试剂 B：2.1g NaHCO3，0.43g Na2HPO4·12H2O; 试剂 C：0.277g CaCl2; D：2.072g C6H12O6。配制时，将 A、B 试剂溶解在装有 800ml 纯水的量筒中，将 试剂 C 单独溶解在装有 100ml 纯水的烧杯中制备成母液 C，将母液 C 缓慢加入量 筒中，并用玻璃棒搅拌，使液体澄清。最后加入试剂 D，加纯水定容至 1000ml。 将液体移至蓝口瓶中，置于冰上，通混合氧（95%O2，5%CO2）30min 以上。

2. 300g/L 蔗糖溶液：称取蔗糖 9g，用 1× PBS 溶解定容至 30ml。

3. TPBS 溶液（含 0.05%吐温 20 的 1×PBS 缓冲液）：取 50μl 吐温 20 于 100ml 1×PBS 中，涡旋混匀，4℃避光保存。

4. 5%BSA/0.3% Triton X-100/1×PBS：称取 BSA 0.5g，加入 10ml 1×PBS 涡旋 溶解后，加入 30μlTriton X-100 涡旋混匀。

5. 肌间神经丛、黏膜层全层铺片制备
   1）颈椎脱臼法处死大鼠，打开腹腔，迅速取出结肠、膀胱置于 Kreb’s 溶液中。
   2）将肠截成小段，用去针头的注射器快速冲洗结肠内部残余粪便；将膀胱置于体式显微镜下，针头固定。
   3）将肠段固定于玻璃棒上，除去肠管周围结缔组织，用镊子沿肠系膜附着处轻刮出一条纵向裂隙，使用 Kreb’s 溶液润湿的棉签轻轻地拉开纵行肌（从裂隙的顶部开始），围绕肠管缓慢分离(将肠端反过来套在玻璃棒上，重复以上操作，分离黏膜层)；膀胱使用显微镊从一角慢慢分离。
   4）将分离的的肌间神经丛面朝上，置于载玻片上。
   5）置于 4℃，4%多聚甲醛溶液中固定 4-6h 后，1×PBS 洗净。
   6）置于 4℃，300g/L 蔗糖溶液中过夜，1×PBS 洗净。
   7）将铺片用刀片切成 10mm×10mm 小块。

五、注意事项

以上实验步骤组织始终处于通着低流量混合氧的 Kreb’s 溶液中，且在冰上进行。