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mRNA逆转录操作步骤

习思雨 |  2022-11-23  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v999
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视频简介逆转录(Reverse Transcription)是以RNA为模板,在逆转录酶的催化作用下,合成RNA/DNA杂合双链,然后水解杂合双链中的RNA,得到互补的单链cDNA的过程。得到的cDNA单链可以作为扩增模板,合成双链DNA。cDNA的合成可以用与后续的PCR实验、qpcr实验、基因检测、基因工程等各个领域。 而在本实验中,我们进行mRNA逆转录的过程中所使用到的是南京诺唯赞生产的通用性逆转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper);同时逆转录操作全过程在超净台中进行,实验中使用到的枪头等均无菌无酶,以上实验步骤仅供大家参考,如存在操作不当或解说不规范的情况,也请各位及时指出。
  • 视频介绍

一、视频摘要

逆转录也称为反转录,以mRNA为模板合成cDNA的过程。在日常的细胞实验中,我们经常需要判断目的基因在细胞中的表达水平,qPCR便是一个很好的检测方法。但在进行qPCR之前,我们首先需要提取组织细胞总RNA,并进行逆转录,以其中的mRNA为模板,采用特异性引物、olig-dT或随机引物,在逆转录酶(reverse transcriptase)的作用下反转录成cDNA,最终再以cDNA作为模板,通过特异性引物,PCR扩增目的基因。

二、关键词

mRNA逆转录、细胞总RNA、逆转录

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1.样品信息

细胞总mRNA

2.试剂和耗材

mRNA逆转录试剂盒、PCR管、黄白枪头、移液枪

3.仪器和软件

PCR仪

四、实验操作

  1.  基因组DNA去除。在无酶离心管中加入2µl 5*gDNA wiper Mix、10pg-1µg总RNA,后加入RNase-free ddH2O至10µl,用移液枪吹打混匀,将样品放置在PCR仪器上,42℃ 2min。

  2. 配制第一链cDNA合成反应液。在无酶离心管中加入上一步混合液(10µl)、2µl10*RT Mix、2µlHiScript III Enzyme Mix、1µlOligo (dT) 20VN、1µlRandom hexamers,用移液器轻轻吹打混匀,将样品放置在PCR仪器上,37℃ 15min,85℃ 5sec。

五、注意事项

  1. 产物可立即用于qPCR反应,或在-20℃保存,并半年内使用.

  2. 长期存放建议分装后置于-70℃保存

  3. cDNA应避免反复冻融

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