一、视频摘要
逆转录也称为反转录,以mRNA为模板合成cDNA的过程。在日常的细胞实验中,我们经常需要判断目的基因在细胞中的表达水平,qPCR便是一个很好的检测方法。但在进行qPCR之前,我们首先需要提取组织细胞总RNA,并进行逆转录,以其中的mRNA为模板,采用特异性引物、olig-dT或随机引物,在逆转录酶(reverse
transcriptase)的作用下反转录成cDNA,最终再以cDNA作为模板,通过特异性引物,PCR扩增目的基因。
二、关键词
mRNA逆转录、细胞总RNA、逆转录
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1.样品信息
细胞总mRNA
2.试剂和耗材
mRNA逆转录试剂盒、PCR管、黄白枪头、移液枪
3.仪器和软件
PCR仪
四、实验操作
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基因组DNA去除。在无酶离心管中加入2µl
5*gDNA wiper Mix、10pg-1µg总RNA,后加入RNase-free
ddH2O至10µl,用移液枪吹打混匀,将样品放置在PCR仪器上,42℃
2min。
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配制第一链cDNA合成反应液。在无酶离心管中加入上一步混合液(10µl)、2µl10*RT Mix、2µlHiScript III Enzyme Mix、1µlOligo (dT) 20VN、1µlRandom hexamers,用移液器轻轻吹打混匀,将样品放置在PCR仪器上,37℃
15min,85℃
5sec。
五、注意事项
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产物可立即用于qPCR反应,或在-20℃保存,并半年内使用.
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长期存放建议分装后置于-70℃保存
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cDNA应避免反复冻融
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