mRNA逆转录操作步骤

一、视频摘要

逆转录也称为反转录，以mRNA为模板合成cDNA的过程。在日常的细胞实验中，我们经常需要判断目的基因在细胞中的表达水平，qPCR便是一个很好的检测方法。但在进行qPCR之前，我们首先需要提取组织细胞总RNA，并进行逆转录，以其中的mRNA为模板，采用特异性引物、olig-dT或随机引物，在逆转录酶（reverse transcriptase）的作用下反转录成cDNA，最终再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。

二、关键词

mRNA逆转录、细胞总RNA、逆转录

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1.样品信息

细胞总mRNA

2.试剂和耗材

mRNA逆转录试剂盒、PCR管、黄白枪头、移液枪

3.仪器和软件

PCR仪

四、实验操作

1.  基因组DNA去除。在无酶离心管中加入2µl 5*gDNA wiper Mix、10pg-1µg总RNA，后加入RNase-free ddH2O至10µl，用移液枪吹打混匀，将样品放置在PCR仪器上，42℃ 2min。

2. 配制第一链cDNA合成反应液。在无酶离心管中加入上一步混合液（10µl）、2µl10*RT Mix、2µlHiScript III Enzyme Mix、1µlOligo (dT) 20VN、1µlRandom hexamers，用移液器轻轻吹打混匀，将样品放置在PCR仪器上，37℃ 15min，85℃ 5sec。
   

五、注意事项

1. 产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并半年内使用.

2. 长期存放建议分装后置于-70℃保存

3. cDNA应避免反复冻融