水稻染色质免疫共沉淀
ChIP Assay in Rice   

材料与试剂

1. 进口1.5 ml离心管和进口50 ml离心管
   
2. 面巾纸
   
3. 96孔酶标板
   
4. 磁珠 (Protein A/G beads，Invitrogen, catalog numbers: 10002D, 10003D)
   
5. 幼嫩的水稻组织
   
6. 液氮
   
7. 肝糖原 (Glycogen，Invitrogen, catalog number: 00507460)
   
8. 乙醇
   
9. 甲醛 (Sigma, catalog number: F8775)
   
10. 2 M甘氨酸
    
11. NaHCO₃ (Sigma)
    
12. 0.1 M PMSF (-20 °C) (Amresco, catalog number: M145-5G)
    
13. 100x Protease inhibitors (PIs, -20 °C) (Roche, catalog number: 11873580001)
14. 3 M β-ME (2-mercaptoethano, RT)
    
15. 20 mg/ml Proteinase K (-20 °C) (Fermentas, catalog number: EO0491) (Takara, catalog number: D9033)
    
16. 10 mg/ml RNase A (DNase-free, -20 °C) (Fermentas, catalog number: EN0531)
    
17. Tris saturated PHenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) (RT) (Sigma-Aldrich, catalog number: P3803)
    
18. Chloroform (RT)
    
19. 3 M Sodium acetate (NaOAc, pH 5.2) (4 °C)
    
20. 20 mg/ml Glycogen (-20 °C) (Roche, catalog number: 10901393001)
    
21. 70% and 100% Ethanol (RT)
    
22. Antibody to be used for ChIP (-20 °C)
    
23. Protein A/G Dynabeads beads (4 °C) (Invitrogen, catalog number: 100.03D)
    
24. 0.5 M EDTA (pH 8.0, 4 °C)
    
25. 5 M LiCl (4 °C)
    
26. 1 M MgCl₂ (4 °C)
    
27. 5 M NaCl (RT)
    
28. 20% NP40 (Sigma, RT)
    
29. 10% SDS (RT)
    
30. 10% Sodium deoxycholate (上海生工分装, catalog number: 0613, RT)
    
31. 2 M Sucrose (4 °C)
    
32. 1 M Tris-HCl (pH 6.5 and pH 8.0, 4 °C)
    
33. 20% Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787, 4 °C)
    
34. Extraction buffer 1 (见溶液配方)
    
35. Extraction buffer 2 (见溶液配方)
    
36. Extraction buffer 3 (见溶液配方)
    
37. 2x Nuclei lysis buffer (见溶液配方)
    
38. Elution buffer (见溶液配方)
    
39. High salt wash buffer (见溶液配方)
    
40. LiCl wash buffer (见溶液配方)
    
41. 1x TE buffer (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超净工作台
   
2. 量筒
   
3. 研钵
   
4. 摇床
   
5. 漏斗
   
6. 移液枪
   
7. 冷冻离心机
   
8. 超声波仪 (Diagenode, model: UCD-200)
   
9. 真空泵
   
10. 振荡器
    
11. 静音混合器 (Qilinbeier, model: WH986)
    
12. 磁力架 (Dynal, Invitrogen bead separation)
    
13. 酶标仪
    
14. 滤膜 (膜布) Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855)
    
15. 水浴锅
    
16. -20 °C冰箱
    
17. -80 °C冰箱
    

实验步骤

实验之前：
在进行水稻染色质免疫共沉淀实验之前，首先需要确定：1)材料的取样时期和部位，2)需要用到的抗体。
对于水稻而言，过于老化成熟的组织会让甲醛交联过程难以奏效，应尽量避免使用；而选取幼嫩的组织 (如发芽后的幼苗，幼嫩的叶片或者幼穗等) 进行分析，可以使得甲醛充分浸润，提高交联效率，从而提高实验的成功率。
抗体的选择主要依据实验目的而定，如果是进行表观遗传修饰的分析，则可以根据实验需要选取H3K4，H3K27等抗体；如果是分析转录因子的结合位点，则需要用到转录因子自身的特异性抗体或者与转录因子融合的标签抗体 (如HA，Flag，GFP等)

1. 实验材料的交联处理 (室温)
   1.1

   取幼嫩的水稻组织 (如发芽后的幼苗，幼嫩的叶片或者幼穗等) 2克左右，将材料剪成尽可能的小的碎片装入50 ml离心管中，加入40 ml灭菌ddH₂O清洗一遍，完全除去水分，加入含1%甲醛的Extraction buffer 1 (见溶液配方1)，即交联液30 ml，真空交联15-30 min。
   注：
   

   1)

   如果材料从田间或温室获得，则先用ddH2O清洗干净，并用面巾纸吸干水分。
   

   2)

   为防止样品在交联过程中漂浮起来，可以用尼龙布或纱布将样品包好，或者用其他策略确保样品在交联过程中完全浸润在交联液中。
   

   3)

   交联的时间是实验成败的关键因素之一，交联时间太短，则交联不够充分，难以沉淀到目的片段，交联时间太长，则容易产生过高的背景噪音。因此针对不同的实验条件和组织材料，实验人员应对交联的时间进行摸索和调整。一般而言，当交联的材料变得透明为宜。 
   1.2

   交联完毕后加入2 ml 2 M甘氨酸使甘氨酸终浓度到达0.125 M，混匀之后将样品重新放入真空仪，抽真空5 min终止交联反应。
   注：真空泵升压的时候，应保持缓慢匀速，避免箱内压力的剧烈变化。
   
   1.3

   反应结束后在离心管中加入40 ml ddH₂O将样品清洗三遍，之后取出样品，放在多层面巾纸之间，尽可能的吸干水分，之后将交联好的样品放入液氮中，置于-70 °C保存(也可以直接进行下一步)。
   注：样品取出后要尽可能完全的除去水分，以免影响后续的染色质抽提的过程。
   
   
   
2. 实验材料的染色质抽提 (冰上进行)
   2.1

   用50 ml的离心管量取30 ml的Extraction buffer 1 (见溶液配方1) 放在冰上预冷 (此为一份样品的量)。
   
   2.2

   取出交联好的样品，用液氮充分研磨成粉末，在30 ml预冷的Extraction buffer 1中加入1.5克样品粉末，盖好盖子，迅速摇匀，将离心管埋入冰中，将冰盒放在摇床上抽提30 min至均匀的悬浮液 (Video 1)。
   
   

   

   Video 1. 液氮磨样及30分钟冰上孵育

   
   
   2.3

   将单层的膜布 (Miracloth) 至于干净漏斗之上，过滤样品悬浮液至新的50 ml离心管，换用双层的膜布 (Miracloth) 重复以上步骤 (Video 2)。
   
   

   

   Video 2. 样品过滤

   
   
   2.4

   用Extraction buffer 1平衡离心管，4 °C离心，4,000 x g，20 min。
   
   2.5

   离心结束后立即取出离心管，小心倒去上清，加入1 ml Extraction buffer 2 (见溶液配方2)，对准离心管壁的沉淀部分反复的轻柔吹洗，大约10-20次后将重悬液转移至1.5 ml离心管中。
   注：在吹洗管壁沉淀的时候，注意保持50 ml离心管仍然在冰上。
   
   2.6

   4 °C离心，16,000 x g，10 min。
   
   2.7

   用枪吸干上清，加入500 µl Extraction buffer 3 (见溶液配方3) 在冰上重悬染色质沉淀。
   注：
   

   1)

   此步骤中，得到的染色质沉淀应为白色或浅绿色，如果为深绿色，说明杂质较多，可以加入1 ml Extraction buffer 2重复第2.6步，直至得到纯净的染色质。
   

   2)

   由于Extraction buffer 3非常粘稠，因此在进行重悬的时候会比较困难，但是应小心避免产生气泡，少量的PMSF同样可以起到去除气泡的作用。

   
   
   2.8

   取一新的1.5 ml离心管，加入500 µl Extraction buffer 3，然后小心将第2.7步中的重悬液转移至其上 (Video 3)。
   
   

   

   Video 3. EB3梯度离心体系配制

   
   
   2.9

   4 °C离心，16,000 x g，1 h。
   
   2.10

   离心好后用枪吸干上清，加入400 µl 2x Nuclear lysis buffer (见溶液配方4) 至染色质沉淀中，重新在核裂解液中悬浮染色质。
   注意：在重悬的过程中应注意避免气泡的产生。
   
   
   
3. 染色质的超声波片段化(冰上进行)
   3.1

   重悬之后，每个样品取2 µl保存作为超声前的对照，然后用超声仪将样品片段化成合适大小的DNA片段。
   注：本实验室超声仪的使用方法：

   1)

   Diagenode超声波仪准备及设置：添加4度冷水至仪器水位刻度线，将能量旋钮调整为最高级别 (High)，超声波时间设定为超声30s、停顿30s。
   

   2)

   将盛有样品的1.5ml离心管放于转子孔内固定，放于仪器中。
   

   3)

   开启超声波仪，仪器工作约15分钟左右，样品可打碎至400-1,000bp之间。工作约30分钟左右，样品可打碎至200bp左右 (见图1)。

   
   
   图1. 不同超声时间下染色质的片段化范围
   
   
   3.2

   取10 µl超声波片段化之后的染色质裂解液和超声前的2 µl对照分别加入500 μl灭菌ddH₂O和20 μl 5 M NaCl，65 °C水浴解交联过夜，剩下的染色质裂解液保存于-80 °C备用。
   
   3.3

   取出解交联产物，加入等体积的25:24:1，手摇混匀5 min，16,000 x g离心10 min，小心吸上清480 µl左右至新离心管中，加入100 µl 3M NaAc，900 µl预冷的无水乙醇和2 µl肝糖原，置于-70 °C沉淀1小时以上或-20 °C沉淀过夜。
   
   3.4

   4°C离心，16,000 x g，20 min，小心弃上清，加入1 ml 70%乙醇洗沉淀一次，4 °C离心16,000 x g，5 min，小心弃上清，稍离心，用枪头小心吸干剩余残液，之后将离心管置于超净台上风干大约15-30 min，加入15 µl ddH₂O溶解半小时以上，用1.5%-2%浓度的琼脂糖凝胶进行检测，若片段大小符合预期则进行下一步实验，如果片段过大，则可继续进行超声波处理。
   
   
4. 染色质前处理和免疫共沉淀(4 °C)
   4.1

   孵育抗体和磁珠 (Protein A/G beads) (Tube A’和Tube B’)

   1)

   取1 ml的0.3x Nuclei lysis buffer至1.5 ml离心管中，然后加入充分悬浮的Protein A/G beads 80 µl，在静音混合器上洗涤10 min，4 °C，之后置于磁力架上2 min，中间轻轻颠倒磁力架，使管盖上的磁珠重悬，打开盖子直接在磁力架弃管中液体，再用1 ml 0.3x Nuclei lysis buffer重悬，重复以上步骤三次 (Video 4)。最后用1 ml 0.3x Nuclei lysis buffer重悬。每个样品准备两管，分别标注为Tube A’(Antibody)和Tube B’(IgG or No-Antibody)。
   
   

   

   Video 4. Beads清洗方法

   
   

   2)

   在标记为Tube A’的离心管中加入5 μg抗体，在标记为Tube B’的离心管中加入IgG或者不加抗体，将离心管置于4 °C静音混合器上，颠倒旋转孵育5 h或过夜，让抗体和磁珠结合 (Video 5)。

   
   

   

   Video 5. 抗体添加及孵育

   
   

   注：加入抗体的多少由抗体的效价，样品的多少等诸多因素决定。一般而言，每25 μg的染色质DNA加入5 μg的抗体。实验者亦可根据实际情况进行增减。 

   
   
   4.2

   染色质的预处理 (Tube A和Tube B)

   1)

   取1 ml的0.3x Nuclei lysis buffer至1.5 ml离心管中，然后加入充分悬浮的Protein A/G beads 40 µl，在静音混合器上洗涤10 min，4 °C，之后置于磁力架上2 min，中间轻轻颠倒磁力架，使管盖上的磁珠重悬，打开盖子直接在磁力架弃管中液体，重复以上步骤三次。最后用1 ml 0.3× Nuclei lysis buffer重悬。每个样品准备两管，分别标注为Tube A (Antibody)和Tube B (IgG or No-Antibody)。
   

   2)

   取出3.2中保存在-80 °C的片段化染色质溶液，4 °C离心，16,000 x g，5 min，吸取20 µl上清作为Input对照。
   注：此处可以取10 µl上清用于后续western检测的。 
   

   3)

   将剩余的上清小心的平均转移到4.2 1)中的Tube A和Tube B离心管中，将离心管置于4 °C静音混合器上，孵育1-6小时以上，以消除背景。 
   4.3

   免疫沉淀

   1)

   将4.2中的Tube A，Tube B和4.1中的Tube A’，Tube B’同时置于磁力架上，2 min，用枪小心吸掉Tube A’，Tube B’的上清，然后用枪小心将Tube A，Tube B中预处理的染色质溶液转移至对应的Tube A’，Tube B’离心管中。
   

   2)

   将离心管置于4 °C静音混合器上，孵育6小时或以上。 
   
   
5. 洗脱蛋白质-DNA复合物并释放DNA (4 °C)
   5.1

   孵育结束后，将离心管置于磁力架上，直接拿着磁力架弃管中上清，按顺序依次加入下列washing buffer各1 ml，颠倒离心管让磁珠完全悬浮，然后将离心管置于磁力架上, 2 min，直接拿着磁力架弃管中上清。

   1)

   0.5x Nuclei lysis buffer    一次快速，一次5 min
   

   2)

   High salt wash buffer     一次快速，一次5 min
   

   3)

   LiCl salt wash buffer       一次快速，一次5 min
   

   4)

   TE buffer                         一次快速，一次5 min

   注：快速洗涤时仅需将磁珠完全重悬后即可立即放在磁力架上，第二次洗涤时，则需要将离心管置于静音混合器上，4 °C，洗涤5 min，然后再将其放在静音混合器上，2 min。

   5.2

   最后一次TE buffer后完全吸干上清，加250 µl Elution buffer，65 °C水浴15 min，每隔3 min颠倒一次，之后将离心管置于磁力架上，2 min，中间颠倒磁力架数次，以将管盖上的磁珠重悬，小心吸取上清至新的1.5 ml离心管中。
   
   5.3

   重复5.2，将两次的上清混合至同一离心管中。
   
   5.4

   取出4.2 2)中-80 °C保存的Input对照，加入500 µl ddH₂O，然后分别在Input和5.3中洗脱后的染色质中加入20 µl 5 M NaCl，65 °C水浴，解交联六个小时以上。
   
   
6. 纯化DNA (室温)
   6.1

   在解交联产物中加入10 µl 0.5 M EDTA，20 µl Tris-HCl pH 6.5，2 µl Proteinase K (20 mg/ml)和1 μg RNase A，45 °C水浴1小时。
   
   6.2

   取出离心管，加入等体积的25:24:1，手摇混匀5 min，16,000 x g离心10 min，吸上清 (480～500 µl)至新离心管中，加入100 µl 3 M NaAc，900 µl预冷的无水乙醇和2 µl甘糖原，置于-70 °C 1小时以上或-20 °C过夜。
   
   6.3

   4 °C离心，16,000 x g，20 min，小心弃上清，加入1 ml 70%乙醇洗盐，4 °C离心16,000 x g，5 min，小心弃上清，稍离心，用枪头小心吸干剩余残液，之后将离心管置于超净台上风干大约15-30 min，加入50 µl TE buffer溶解半小时以上。
   
   6.4

   用Picogreen assay (Invitrogen Q-bit) 和Agilent BioAnalyzer DNA 1000 chip (见图2) 分别对DNA的浓度进行测定，之后样品置于-20 °C保存或进行后续分析。 
   
   
   图2. Agilent BioAnalyzer DNA 1000 chip对ChIP DNA分析结果示意图
   
   
7. 用Picogreen对ChIP DNA进行定量
   7.1

   按如下表格在96孔酶标板中准备DNA标准品：
   
   
   7.2

   取1 µl ChIP DNA加入49 µl TE buffer，混匀。
   
   7.3

   用1x TE buffer稀释20x picogreen试剂。取Aliquot 50 µl 1x picogreen至每个待测的孔中。
   注：Input至少稀释10倍，以保证其浓度落入标准品范围之内。
   7.4

   用酶标仪进行测定，测定模式Fluorescence Top，Excitation wavelength: 485 nm，Emission wavelength: 535 nm，记录读数并计算ChIP DNA浓度。

溶液配方

1. Extraction buffer 1
   
   
   
2. Extraction buffer 2
   
   
   
3. Extraction buffer 3
   
   
   
4. 2x Nuclei lysis buffer
   
   
   
5. Elution buffer
   
   
   
6. High salt wash buffer
   
   
   
7. LiCl wash buffer
   
   
   
8. 1x TE buffer