水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定
Determination of Superoxide Dismutase (SOD) Activity in Rice   

材料与试剂

1. 样品袋
   
2. 冰盒
   
3. 10 ml离心管
   
4. 2 ml离心管
   
5. 遮光物
   
6. Na₂HPO₄ (天净光复科技发展有限公司)
   
7. NaH₂PO₄ (天净光复科技发展有限公司)
   
8. 甲硫氨酸 (Met) (武汉创新生物技术有限公司, catalog number: BA1081)
   
9. EDTA-Na₂ (生工生物, catalog number: E0105-500g)
   
10. 氮蓝四唑 (NBT)
    
11. 0.05 mol/L磷酸缓冲液 (见溶液配方)
    
12. 130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液 (见溶液配方)
    
13. 750 µmol/L氮蓝四唑溶液 (见溶液配方)
    
14. 100 µmol/L EDTA-Na₂溶液 (见溶液配方)
    
15. 20 µmol/L核黄素溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. pH试纸 (Sigma, catalog number: P-4536)或pH计(Satorius, catalog number: PB-10)
   
2. 剪刀
   
3. 研钵
   
4. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: centrifuge 5417R)
   
5. 分析天平 (Adventurer, USA)
   
6. 分光光度计 (BECKMAN DU^® 640 Spectrophotometer)

实验步骤

1. 水稻组织样品准备，到温室或田间取样，立即放置于样品袋中，存放于冰盒中带回实验室。
   
2. 酶液提取
   在天平上迅速称取水稻组织0.3-0.5 g，剪刀剪碎到预冷的研钵中，加1 ml预冷的磷酸缓冲液，在冰浴上研磨成浆，研磨过程中补加缓冲液使终体积为4 ml。将研磨液倒于10 ml离心管中，4 °C 5,000 x g离心10 min。上清液即为SOD粗提液。
   
3. 显色反应
   取2 ml离心管若干 (要求透明度好)，其中2个离心管做对照用，按下表加入各种溶液，各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管迅速混匀，放置于光照培养室中反应10 min-30 min (保证各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低时间延长)。
   
4. SOD活性测定，至反应结束后，全部移入冰盒中，其上可覆盖遮光物，再冷冻离心12,000 x g后取适量反应液测定，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。
   注意：用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零，各试剂按比例混合好 (1.3 ml缓冲液 + 0.16 ml甲硫氨酸 + 0.16 ml氮蓝四唑 + 0.16 ml EDTA Na₂ + 0.06 ml蒸馏水) (表1)，再加60 μl酶液，核黄素0.16 ml最后单独加入，总体积2.0 ml。
   
   表1. SOD活性测定的试剂量
   
   
   
5. SOD活性计算，计算公式：
   SOD (U/g.FW) = (A_ck-A_E) * V_T/A_ck/0.5/W/Vs
   公式中式符号表示：
   V_T-总酶液量(ml)
   Vs-所用酶液量(50 μl)
   W-叶片鲜重(g)
   A_ck-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度
   A_E-样品管吸光度
   

注意事项

1. 为了保证较好的实验结果，测定生理指标时，所有检测样品质量保持相近。
   
2. 研磨过程中可先加磷酸缓冲液3 ml，最后再用1 ml磷酸缓冲液清洗研钵中残留。
   
3. 如果是老叶片或胁迫后含水量较低叶片，可多加磷酸缓冲液至5-6 ml，具体用量视样品质量及组织情况而定。
   
4. 操作过程很多需要冰上操作，应严格执行，否则会影响酶活的测定结果。
   

溶液配方

1. 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)
   91.5 ml 0.05 M Na₂HPO₄
   8.5 ml 0.05M NaH₂PO₄
   
2. 130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液
   称1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 ml
   
3. 750 µmol/L氮蓝四唑溶液
   称取0.06133 g NBT用磷酸缓冲液定容至100 ml，避光保存
   
4. 100 µmol/L EDTA-Na₂溶液
   称取0.03721 g EDTA-Na₂，用磷酸缓冲液定容至1,000 ml
   
5. 20 µmol/L核黄素溶液
   称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1,000 ml，避光保存