果蝇翅成虫盘RNA原位杂交技术
RNA in situ Hybridization in Drosophila Wing Imaginal Discs   

材料与试剂

1.  移液枪头
2. 1.5 ml塑料离心管 (Corning, AXYGEN, catalog number: MCT-150-C)
3.  果蝇三龄幼虫
4. VectorRed AP substrate Kit (Maravai LifeSciences, Vector Laboratories, SK-5100)
5. NBT/BCIP (Thermo Fisher Scientific, catalog numbers: LA01, LA02)
6. 抗地高辛碱性磷酸酶抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
7. 抗地高辛辣根过氧化氢酶抗体 (Roche, catalog number: 1207733)
8. PBS缓冲液 (Coolaber, catalog number: PM272215100)
9. 吐温-20 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 30189380)
10. 甲酰胺 (VWR Life Science, AMRESCO, catalog number: 0314-500ML)
11. 20× SSC (Solarbio, catalog number: S1035)
12. 肝素 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S9276)
13. 鲑鱼精子DNA (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: D1626)
14. 氯化钠 (NaCl₂, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: S7653)
15. 六水合氯化镁 (MgCl₂•6H₂O, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: M2393)
16. 左旋咪唑 (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: L9756)
17. 三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 (1 M Tris-HCl pH 8.8, Solarbio, catalog number: T1010)
18. 4%多聚甲醛 (Paraformaldehyde, PFA) (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 441244)
19. 醋酸铵 (NH₄OAc, Merck, Sigma-Aldrich, 631-61-8)
20. 乙醇 (CH₃CH₂OH, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: E7148)
21. 甲醇 (CH₃OH, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: 67-56-1)
22. DEPC (Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: D5758)
23. 转录缓冲液 (Transcription buffer, Roche, catalog number: 11465384001)
24. 地高辛RNA标记混合液 (DIG RNA Labeling Mix, Roche, catalog number: 11277073910)
25. T7 RNA聚合酶 (T7 RNA Polymerase, Roche, catalog number: 10881767001)
26. SP6 RNA聚合酶 (SP6 RNA Polymerase, Roche, catalog number: 10810274001)
27. RNA酶抑制剂 (RNAase inhibitor, Roche, catalog number: 3335399001)
28. 碳酸钠 (Na₂CO₃, Merck, Sigma-Aldrich, 497-19-8)
29. 碳酸氢钠 (Na₂HCO₃, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: Q0380)
30. 醋酸钠 (NaOAc, Merck, Sigma-Aldrich, 6131-90-4)
31. 氯化锂 (LiCl, Merck, Sigma-Aldrich, 7447-41-8)
32. 转运RNA (tRNA, Merck, Sigma-Aldrich, catalog number: A5253-500G)
33. PBSTw溶液 (见溶液配方)
34. Hyb B (见溶液配方)
35. Hyb A (见溶液配方)
36. 碱性磷酸酶染色溶液 (见溶液配方)
37. DEPC水 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器 (Gilson, models: P2-P1000)
2. -80 °C超低温冰箱 (Esco, Lexicon, model: UUS-668B-1)
3. 4 °C及-20 °C冰箱 (Haier, model: BCD-539WT)
4. 恒温水浴锅 (Thermo Fisher Scientific, model: ISOTEMP 202)
5. 摇床 (杭州米欧，model: RH-24)
6. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5415D)
7. 激光扫描共聚焦显微镜 (Leica, model: TCS SP8)
8. 电子天平 (Mettler Toledo, model: PL602-S)
   

实验步骤

1. RNA探针制备
   RNA探针一般设计为200 nt以上，探针浓度一般在500 μg/μl左右。用来合成RNA探针的模板DNA通过PCR方法制备，正义链5’端加SP6 RNA聚合酶结合序列，反义链5’端 (即模板DNA的3’端) 加T7 RNA聚合酶结合序列，以供转录。反义探针用于检测目标RNA，正义探针为阴性对照。
   
   1.1

   在1.5 ml塑料离心管中依次加入13 μl DNA 片段 (总量2 μg)，2 μl转录缓冲溶液，2 μl地高辛RNA标记混合液，2 μl T7/SP6 RNA聚合酶 (T7反义探针，SP6正义探针)，1 μl RNAase抑制剂。将离心管置于37 °C恒温金属浴孵育5~10 h。反应结束后，取1 μl反应产物进行DNA凝胶电泳，用于检测探针合成质量。
   1.2

   在离心管中加入30 μl DEPC水，25 μl 240 mM Na₂CO₃，25 μl 160 mM Na₂HCO₃，混合均匀置于60 °C恒温金属浴孵育10 min对探针进行碳酸化处理。
   1.3

   在离心管中依次加入100 μl 0.3 M NaOAc，20 μl 6 M LiCl，4 μl 50 μg/μl tRNA和600 μl乙醇。
   1.4

   将离心管置于-20 °C冰箱过夜用以沉淀RNA探针。
   1.5

   将离心管置于4 °C冷冻离心机以20,000 × g转速离心30 min。弃上清。
   1.6

   加入500 μl 70%乙醇/DEPC水，颠倒5~10次使RNA沉淀漂浮进行洗涤。将离心管置于4 °C冷冻离心机以20,000 × g转速离心30 min。弃上清。
   1.7

   晾干沉淀并加入100 μl DEPC水，将探针储存于-80 °C超低温冰箱。
   
   
2. 组织原位杂交
   准备
   
   2.1

   在PBS缓冲液中解剖果蝇三龄幼虫，暴露翅成虫盘。具体流程请参照“果蝇翅成虫盘免疫荧光染色” (高远等，2019) 中组织解剖部分。将解剖完毕的果蝇组织置于1.5 ml离心管中。
   2.2

   (预固定处理) 在离心管中加入含4% PFA的PBS缓冲液 (固定剂)，置于室温固定20 min。
   2.3

   去除固定剂，并加入500 μl的0.3 M NH₄OAc溶液。再去除0.3 M NH₄OAc溶液，并加入新的500 μl的0.3 M NH₄OAc溶液。逐滴加入500 μl乙醇并轻轻颠倒混匀。
   2.4

   (脱水) 去除溶液后加入无水乙醇，在摇床上10 min以完全脱水，重复此步骤3次。此时组织可被储存于-20 °C。
   
   
   第一天
   
   2.5

   (脱水) 去除离心管中的乙醇，加入1 ml甲醇置于摇床上洗涤2 min，重复1次。
   2.6

   (再水化) 去除离心管中的甲醇，依次加入不同浓度的PBSTw (PBS缓冲液加入0.05%吐温-20)/甲醇混合溶液 (30% PBSTw/70%甲醇、50% PBSTw/50%甲醇、70% PBSTw/30%甲醇) 各洗涤2次，每次均置于摇床上洗涤2 min。
   2.7

   使用PBSTw溶液洗涤2次，每次均置于摇床上洗涤2 min。
   2.8

   (固定) 去除PBSTw溶液，加入含4% PFA的PBSTw溶液 (固定剂)，置于摇床上固定20 min。
   2.9

   去除固定剂，使用PBSTw溶液中洗涤5次，每次均置于摇床上洗涤5 min，以彻底去除固定剂。预留一部分果蝇组织用以预处理抗地高辛碱性磷酸酶抗体(见步骤2.15)。
   2.10

   加入50% PBSTw/50% Hyb B溶液，置于摇床上洗涤5 min。
   2.11

   去除50% PBSTw/50% Hyb B溶液，加入Hyb B溶液中置于摇床上洗涤5 min。
   2.12

   (预杂交) 去除Hyb B溶液，加入150 μl Hyb A溶液，置于65 °C恒温金属浴孵育2 h。
   2.13

   在99 μl Hyb A溶液中加入1 μl探针，在80 °C恒温金属浴孵育5 min用以破坏探针可能存在的二级结构，并立即置于冰上10 min防止二级结构再生成。
   2.14

   去除65 °C孵育所用Hyb A溶液，并加入探针/Hyb A溶液，65 °C恒温金属浴孵育过夜使得探针与目的RNA进行杂交。
   2.15

   预处理抗地高辛碱性磷酸酶抗体(1:50溶于PBSTw溶液)用于第二天与探针的地高辛标记进行后续免疫显色反应。将抗体稀释液加入第2.9步预留的的果蝇组织，置于摇床上4 °C过夜。
   
   第二天
   
   2.16

   去除探针/Hyb A溶液，使用500 μl Hyb B溶液65 °C恒温金属浴润洗7~12次，每次30 min。
   2.17

   去除Hyb B溶液，依次加入PBSTw (PBS溶液加入0.05%吐温)/Hyb B混合溶液 (30% PBSTw/70% Hyb B、50% PBSTw/50% Hyb B、70% PBSTw/30% Hyb B) 中各洗涤2次，每次均置于摇床上洗涤30 min。
   2.18

   使用PBSTw溶液洗涤5次，每次均置于摇床上洗涤5 min。
   2.19

   去除PBSTw溶液，加入150 μl预处理的抗地高辛碱性磷酸酶抗体与探针的地高辛标记反应 (将预处理的抗体1:40稀释于PBSTw溶液中，抗体终浓度为1:2,000)，置于摇床上4 °C过夜。
   
   第三天
   
   2.20

   去除抗体稀释液，使用PBSTw溶液洗涤5次，每次均置于摇床上洗涤5 min。
   2.21

   去除PBSTw溶液，使用碱性磷酸酶染色溶液洗涤3次，每次均置于摇床上洗涤5 min。
   2.22

   加入碱性磷酸酶底物显色溶液 (5.85 μl NBT/3.3 μl BCIP)，室温避光在摇床上孵育5~30 min。如使用红色荧光底物 (VectorRed AP substrate Kit)，参见试剂盒说明书。
   2.23

   去除显色溶液，使用PBSTw溶液洗涤5次，每次均置于摇床上洗涤5 min。
   2.24

   将翅成虫盘置于甘油中制片，具体流程请参照“果蝇翅成虫盘免疫荧光染色” (高远等，2019) 中制片部分。

结果与分析

原位杂交结果示例 (图1):


图1. 原位杂交实验结果. w¹¹¹⁸基因型果蝇翅成虫盘使用wg反义荧光探针(A) 和wg正义荧光探针 (B) 的VectorRed红色荧光底物显色。比例尺为100 μm。

注意事项

1. 探针的质量
   探针质量是决定原位杂交结果的关键环节。我们一般会通过DNA凝胶电泳对探针质量进行检测。探针应检测到一条轻微弥散的RNA带，过于弥散或者没有条带则代表探针合成质量差 (图2)。
   
   
   图2. wg反义荧光探针的合成检测. 泳道左一，DNA Marker (上数第三条最亮条带为750bp)。泳道左二，wg反义荧光探针反应产物 (RNA探针制备步骤一)。
   
   
2. 所有操作及溶液配制均应在没有RNA酶活性的情况下进行。
3. 为保证较低的背景，用幼虫组织预处理抗体，以去除抗体中的杂质信号。
4. DEPC剧毒，注意防止污染。
   

溶液配方

1. PBSTw溶液
   PBS溶液中加入0.05%吐温-20
   
2. Hyb B (20 ml)
   

   甲酰胺	10 ml
   20× SSC (pH 5.0)	5 ml
   PBS溶液	5 ml

    -20 °C保存
3. Hyb A (10 ml)
   

   甲酰胺	5 ml
   20× SSC (pH 5.0)	2.5 ml
   肝素 (5 mg/ml)	100 μl
   10%吐温-20/PBS	100 μl
   鲑鱼精子DNA (9.5 mg/ml)	105 μl (终浓度100 μg/ml)
   加入PBS溶液至	10 ml

    -20 °C保存
   
4. 碱性磷酸酶染色溶液 (10 ml)
   

   5 M NaCl	200 μl
   1 M Tris-Cl (pH 8.8)	1 ml
   1 M MgCl2•6H2O	500 μl
   10%吐温-20	100 μl
   100 mM左旋咪唑	100 μl
   加入DEPC水至	10 ml

   现用现配
   
5. DEPC水 (1 L)
   1 ml DEPC溶于1 L水中，常温过夜以除去水中RNA酶活性，高压灭菌
   

致谢

本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。本实验方案改编自本实验室的发表文章Du等 (2016)。

参考文献

1. 高远，刘敏，朱健. (2019). 果蝇翅成虫盘免疫荧光染色. Bio-101 e1010260. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010260.
2. Du, J., Zhang, J., He, T., Li, Y., Su, Y., Tie, F., Liu, M., Harte, P. J. and Zhu, A. J. (2016). Stuxnet facilitates the degradation of polycomb protein during development. Dev Cell 37(6): 507-519.