高通量分析果蝇睡眠的实验方法

材料与试剂

1. 橡皮筋
2. 锡箔纸
3. 毛笔
4. 带孔塑料塞
   
5. 果蝇w¹¹¹⁸ (FlyBase ID: FBst0005905)
6. 玉米粉 (食用级)
7. 葡萄糖 (国药，沪试，catalog number: 10010518)
8. 蔗糖 (国药，沪试，catalog number: 10021418)
9. 高活性干酵母 (安琪酵母)
10. 无水乙醇 (国药，沪试，catalog number: 10009218)
11. 对羟基苯甲酸甲酯 (国药，沪试，catalog number: 30119426)
12. 丙酸 (国药，沪试，catalog number: 81011918)
13. 琼脂粉 (天津致远)
    

仪器设备

1. 烧杯
2. 果蝇饲养管 (2.5 x 9.5 cm透明聚苯乙烯塑料管)
3. 光照培养箱 (宁波莱福科技有限公司)
4. 果蝇行为监测系统 (Trikinetics, Waltham, MA, USA)
5. 高压蒸汽灭菌器 (日本松下，model: MLS-3751L-PC)
6. 体式显微镜 (重庆奥特光学仪器有限公司)
7. CO₂麻醉板
   

实验步骤

1. 准备待测果蝇
   使用标准果蝇食物饲养果蝇 (温度：25 °C，湿度：50%，光照：12 h光照/12 h黑暗)；监测果蝇年龄应在2-5天。
2. 准备监测管
   
   1. 用橡皮筋将洁净干燥的玻璃管 (约160根) 扎好后垂直放入500 ml烧杯中，用锡箔纸包裹杯口，准备灭菌。
      
   2. 用双蒸水配置含5%蔗糖和2%琼脂的食物溶液，锡箔纸封住杯口后与监测管一同灭菌。
   3. 待灭菌结束后取出监测管和食物，用移液管将食物沿壁加入烧杯中 (每个烧杯加入50 ml)，待其冷却凝固。
   4. 从烧杯中取出监测管，擦净监测管外壁残余食物，用塑料塞封住食物端。
3. 装配果蝇
   
   1. 用二氧化碳麻醉果蝇。
      注：由于二氧化碳麻醉会对果蝇产生不利影响，麻醉时间应避免超过5 min。
   2. 用毛笔将果蝇移入监测管中 (一根监测管一只果蝇)。
   3. 将装入果蝇的监测管插入监测板中，并用带孔塑料塞封住非食物端。
      注：尽量将同一基因型同一性别的果蝇装在同一块监测板中，并准确记录果蝇基因型及其对应监测板号码和监测管位置。
   4. 待监测板上果蝇装配完成后，尽量使监测管中部 (无食物部分) 对准监测板上红外线发射/接收处，并用橡皮筋固定每根监测管 (图1)。
      
      
      图1. 果蝇活动监测板实物图。图中所示为橡皮筋固定监测管食物端，每两排管用一根皮筋固定。
      
      
      
4. 将监测板放入预先设置好温度和湿度的培养箱中，并用电话线将其与数据收集系统相连。
5. 在电脑上打开数据收集软件，设置收集数据间隔为1 min并确认连接好的监测板已开始收集数据。
   注：一旦开始监测，一直到监测结束，如无必要请勿打开培养箱以免影响果蝇活动导致监测结果受影响。
6. 设置培养箱监测期间光照变化程序，一般是7天12 h光照/12 h黑暗 (7LD)，接下来4天持续光照 (4LL)，其后2天持续黑暗 (2DD)。设置完成后即可等待监测结束。
   注：监测睡眠实验中，7天LD中前3天是果蝇适应环境的时间，分析结果时只采用后4天LD的数据；4天LL会导致果蝇生物钟不能正常工作，因此可以根据LL第四天和DD第一天数据分析果蝇在生物钟功能缺陷时的睡眠，通过LL和DD的比较可得知光或黑暗对睡眠的影响。
   

结果与分析

1. 收集并处理数据
   
   1. 监测结束后将所收集的数据复制到新文件夹中，然后将其导入DAMFileScan软件 (版本：1.0.7.0，Trikinetics) 中。
   2. 在DAMFileScan软件中转换数据格式：在“Bin Length”处设置数据间隔为1 min；在“Output File Type”处设置输出数据文件格式为“Channel Files”；在左侧“First Bin to Save”处设置数据开始日期，时间设置为“00:01:00”；在右侧“Last Bin to Save”处设置数据结束日期，时间设置为最近的时间 (例如，下午三点收集数据，则时间设置为“15:00:00”)；在“Extra Readings”处选择“Sum into Bin”；在“RunName”处为导出数据命名；最后点击“Save”保存即可。
      注：转换数据格式时尽量均以所要分析数据第一天为开始日期，便于后期不同批次实验数据结合。
2. 分析睡眠数据
   睡眠数据分析使用Ravi Allada实验室的Counting Macro (版本：5.19.13)，果蝇睡眠定义为5 min不活动，通过Counting Macro分析可以得到睡眠长度、睡眠片段 (长度/数目)、睡眠潜伏期和活动量等参数。
   
   1. 打开Counting Macro文件，选择工作表“Main” (红色标题)，在这一工作表中点击标题“Drosophila Activity Monitor Counting Macro 5.19.13 2010”即可显示主操作界面。
   2. 导入数据
      
      1)

      在操作界面中点击“Clear ALL Sheets”清除之前的数据；
      2)

      点击“Import Data”，在弹出界面点击“Choose Directory”选择即将导入的数据；
      3)

      在该界面第4部分选中数据对应的监测板编号，勾选“check here if the files have the ‘.txt’ extension”；
      4)

      点击“Import”键完成数据导入。
   3. 设置数据参数 (图2A，图4A)
      
      1)

      数据导入结束后，点击“Main Menu”键回到主操作界面；
      2)

      然后点击“Run Specs”进入“Run Specifications”界面设置数据参数。在“Length of Bins”栏设置数据间隔为1 min，“Number of Inactive Bins to be Sleep”栏设置睡眠标准为连续5 min不活动，“Number of Hours of Light (Dark)”栏分别设置光照 (黑暗) 时长为12 h (12 h)，“Light On Time”这栏选择开灯时间 (例如9:00)；
      3)

      然后根据所分析数据对应的光照条件 (LD/DD) 并勾选“LD(/DD) Analysis”，以LD条件下数据分析为例，在“Run Day to Start Analysis”这栏选择从第1天开始分析，在“# Days of Analysis”一栏选择分析4天数据，在“Offset Hours from Lights On”栏选择数据偏移时间为0；
      4)

      最后点击“OK”完成参数设置。
      注：分析LL阶段数据与DD阶段设置相同。
   4. 鉴别死果蝇 (图2B，图4A)
      在主界面上点击“Fly Triage”键进入死果蝇标准参数设置界面，第1部分选“Label as ‘LD,’ don’t delete”表示数据属于LD阶段，在第2部分选择死果蝇标准“Use Total and End Range Selection Criteria (either)”，第3部分选择数据间隔1 min，数据类型“LD Sleep (Based on LD Run Specs)”，在第4部分“Total Range”区选择“Activity/Bin”设为0.2，“End Range”区选择“Activity/Bin”设为0，在第5部分点击“…”键选择文件目录并设置文件名，最后点击“Go”开始鉴别死果蝇，分析结束后点击“Quit to Excel”键。
   5. 设置监测板及对应果蝇名称 (图2C，图4A)
      进入“MultiSleep”工作表，在表格左列“Analysis Name”输入果蝇基因型，右列则输入这些果蝇对应的监测板编号和监测板上位置。
      注：使用英文格式输入，严格按照表中示范格式填写。
      
      
      图2. 睡眠分析参数设置界面截图。A. 设置数据参数“Run Specifications”界面。B. 鉴别死果蝇 “Fly Triage”界面。C. 设置监测板及对应果蝇名称界面。
      
      
   6. 睡眠数据分析 (图3)
      
      1)

      进入“Main”工作表，打开主操作界面，点击“Sleep Analysis”键进入睡眠分析界面，在“Analysis Type”区域勾选所分析数据类型 (LD/DD)，如果同时分析LD和DD阶段数据则将二者同时勾选；
      2)

      点击“Import”键导入步骤2中设置的参数 (也可重新设置)；
      3)

      点击“Choose Directory”选择分析结果文件保存的位置并在“Enter Name of Summary Book”栏为分析结果总表命名；
      4)

      点击“Analyze”键开始分析。分析完成后该界面左下角会出现“Done”字样，同时分析结果总表会在界面后方打开。
      
      
      图3. 睡眠数据开始分析界面。图中所示分析LD条件下的睡眠，9:00开始亮灯，从第一天开始，分析连续4天数据，分析结果保存在电脑D盘中，分析结果总表命名为“LD sleep”。
   
   
3. 睡眠分析结果说明
   睡眠分析结果以Excel表格形式保存，包括一个总表以及各个基因型对应的分表。以总表为例解释表中各参数含义：
   
   1. 每个工作簿包含6个工作表 (LD)：
      
      1)

      “LD Analysis”表中数据即LD阶段的平均各项参数；
      2)

      “L Analysis”是L阶段各项参数平均值；
      3)

      “D Analysis”是D阶段各项参数平均值；
      4)

      “LD Analysis, detailed”则是LD阶段每一天的各项参数；
      5)

      “L Analysis, detailed”是L阶段每一天各项参数；
      6)

      “D Analysis, detailed”是D阶段每一天的各项参数。(LL/DD类型的数据只有4个工作表)
   2. 每个工作表中主要有以下参数 (以“LD Analysis”为例，其它表类似)：
      
      1)

      “Wake Bins”：果蝇清醒状态的平均每天数据间隔数。
      2)

      “Bins of Sleep”：果蝇睡眠状态的平均每天数据间隔数。
      3)

      “Min. of Sleep”：果蝇平均每天睡眠总时长。
      4)

      “% Sleep”：果蝇睡眠时间所占比例。
      5)

      “Amount of Activity”：对应时期内果蝇穿过红外线总次数，表示果蝇活动总量。
      6)

      “Wake Minutes”：果蝇平均每天清醒总时长。
      7)

      “Waking Activity”：果蝇清醒时平均每分钟穿过红外线次数，表示每分钟果蝇活动量。
      8)

      “Total Bouts Awake”：对应时期内果蝇清醒片段数。
      9)

      “Total Bouts Asleep”：对应时期内果蝇睡眠片段数。
      10)

      “ABL”：对应时期内果蝇睡眠片段平均长度。
   3. 每个工作表中还包含对应参数的标准偏差“STANDARD DEVIATION”、标准误“STANDARD ERROR”以及每种基因型果蝇数目“N”和每只果蝇的各项参数。
4. 分析睡眠潜伏期
   利用Counting Macro还可以分析另一重要的睡眠参数“Latency to Sleep”：即LD阶段的睡眠潜伏期 (从熄灯开始到果蝇第一次入睡的时间)。分析过程如步骤2所述，只是在 设置监测板及对应果蝇名称时进入“Latency”工作表，然后分析时进入“Latency to Sleep”界面设置“Bin Length”为1 min，关灯时间 (例如21:00)，选择数据分析开始天数为第1天及总天数为4，最后在“Choose Directory”处选择分析结果保存位置，点击“Analyze”开始分析，结束后即可得到每种基因型果蝇的睡眠潜伏期数据。
5. 逐小时分析睡眠
   分析过程同上，在工作表“MultiEducer”中 设置监测板及对应果蝇名称，在主界面点击“Sleep Educer”键，进入“Sleep Eduction”界面，在第1部分点击“Input Specs”键选择数据间隔为1 min，分析开始天数为1，开灯时间 (9:00)，然后在“Number of days to Educe”处选择分析天数为4；在第2部分“Length of Interval”处选择分析时长为1 h，在“Ignore flies that have been labeled in triage with”处勾选“LD”，同时勾选图表类型；点击第3部分的“…”键选择结果保存位置，最后点击“Produce Eduction”键导出结果 (图4)。
   
   
   图4. Counting Macro主操作界面及w¹¹¹⁸果蝇睡眠分析结果。A. Counting Macro的主要操作界面。B. w¹¹¹⁸雌蝇4天LD内每小时平均睡眠长度，n = 32。C. w¹¹¹⁸雌蝇连续4天LD每一天每小时平均睡眠长度，n = 32。
   

溶液配方

1. 标准果蝇食物配方
   琼脂粉 5 g
   蔗糖 31.62 g
   葡萄糖 63.2 g
   玉米粉 77.7 g
   酵母 30 g
   丙酸 4.3 ml
   10%对羟基苯甲酸甲酯 (溶于无水乙醇) 10 ml
   双蒸水 1 L
2. 睡眠监测期间果蝇食物配方
   琼脂粉 20 g
   蔗糖 50 g
   双蒸水 1 L
   

致谢

本课题得到国家自然科学基金面上项目 (31471125和31671215) 的支持。感谢Ravi Allada教授提供睡眠分析程序Counting Macro。