果蝇Schneider 2细胞培养

材料与试剂

1. 细胞冻存管 (Corning, catalog number: 430659)
2. 10 ml塑料移液管 (Corning, Costar, catalog number: 4488)
3. 15 ml塑料离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 339650)
4. 50 ml塑料离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 339652)
5. 6孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 140675)
6. 24孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 142475)
7. 细胞培养瓶 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 156367)
8. 细胞培养皿 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 150464)
9. 一次性无菌过滤装置 (Thermo Fisher Scientific, Nalgene, catalog number: 1660045)
10. 程序降温盒 (Thermo Fisher Scientific, Nalgene, 5100-0001)
11. 1 ml带滤芯的移液枪头 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: TF112-1000-Q)
12. 75%酒精消毒液 (ANNJET, 75%酒精消毒液)
13. 胎牛血清 (Cellmax, SA301.02)
14. Schneider果蝇培养基 (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 21720-024)
15. 青链霉素混合液 (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 15140122)
    

仪器设备

1. 二级生物安全柜 (Esco, Airstream A2)
2. 细胞培养箱 (SANYO, MCO-18AIC)：有恒温和保湿功能即可，温度设定为25 °C，湿度设定为70%，果蝇S2细胞培养不需要通入CO₂气体
3. 真空泵 (Millipore, WP6122050)
4. 倒置荧光显微镜 (Leica, DM IL LED)
5. 移液枪 (Drummond, Pipet-Aid XP)
6. 移液器 (Gilson, model: P1000)
7. 恒温水浴锅 (Thermo Fisher Scientific, ISOTEMP 202)
8. -80 °C超低温冰箱 (Esco, Lexicon, UUS-668B-1)
9. 4 °C及-20 °C冰箱 (Haier, BCD-539WT)
   

实验步骤

1. 细胞传代及下游实验准备
   S2细胞是一种半悬浮细胞，在细胞传代时不需要使用胰酶消化。
   
   1.1

   倒置显微镜下观察培养细胞，若密度达到1 × 10⁷/ml则需要进行传代 (图1)。在25 °C培养条件下，一般3天左右进行一次传代。若细胞密度低于0.5 × 10⁵/ml，请勿进行传代，否则细胞增殖会很缓慢。
   
   
   图1. 传代前及传代后细胞形态与密度图. 细胞密度达到左图所示程度时，需要进行传代。右图为传代操作1小时后，细胞完成贴壁时的形态与密度图。比例尺为50 μm。
   
   
   1.2

   将培养基在室温放置，至其温度达到20~25 °C。
   1.3

   准备一个新的细胞培养瓶，加入4.5 ml新鲜的培养基。如果需要进行下游实验，还需要准备好6孔细胞培养板或者24孔细胞培养板。6孔细胞培养板每孔加入1.8 ml培养基，24孔细胞培养板每孔加入450 μl培养基。
   1.4

   使用移液枪从细胞培养瓶底部轻柔地吹起细胞并混匀。
   1.5

   以1:10的比例接种细胞至细胞培养瓶或者细胞培养板中，比如细胞培养瓶中加入500 μl。接种细胞浓度为0.5~1 × 10⁶/ml，接种浓度过低，会导致细胞生长缓慢。部分稳转细胞系需要增加接种量。
   1.6

   轻柔地晃匀细胞，注明细胞传代次数和接种时间，放入25 °C细胞培养箱即可。在该培养条件下，一般12~24小时后可进行细胞转染。
2. 细胞复苏
   S2细胞不是可以无限传代的细胞，一般培养到20~25代的时候需要复苏新的细胞。此时的细胞形态差，贴壁比例降低，生长慢，转染效率低。
   
   2.1

   预热25 °C恒温水浴锅。准备干净的细胞培养瓶一个，加入室温的培养基4 ml。
   2.2

   从液氮中取出一管冻存的S2细胞，在25 °C恒温水浴锅中用手轻柔摇晃。在细胞化冻之后，立即用75%酒精消毒液消毒整个冻存管，然后拿进生物安全柜中。
   2.3

   将化冻的细胞缓慢加入准备好的细胞培养瓶中，轻轻晃动细胞培养瓶，使细胞均匀分布在细胞培养瓶中。
   2.4

   将细胞培养瓶放入25 °C细胞培养箱，等待细胞贴壁。该过程需要6小时左右。
   2.5

   倒置显微镜下观察到大部分细胞贴壁后，更换5 ml室温的培养基。之后每3天按此法更换一次新鲜的培养基，直到细胞开始增殖。一般情况下，从接种到增殖需要4到6天。
   2.6

   细胞增殖到1 × 10⁷/ml的时候即可按1中的方法进行细胞传代及下游实验准备工作。
3. 细胞冻存
   传代次数少的细胞可以进行细胞冻存，以备下次复苏。
   
   3.1

   准备干净的直径为100 mm的细胞培养皿一个，加入9 ml室温的培养基，向其中接种1 ml细胞，接种浓度为0.5~1 × 10⁶/ml。放入细胞培养箱中让细胞增殖。
   3.2

   倒置显微镜下观察细胞密度，当细胞生长到约5 × 10⁶/ml的时候可以开始准备冻存。
   3.3

   准备15 ml塑料离心管一个，2 ml细胞冻存管3个。
   3.4

   用移液器从细胞培养皿中吸出上清至皿中剩余1.5 ml旧培养基。向细胞培养皿中加入1.5 ml室温的培养基，用移液枪将细胞轻轻吹吸悬起。然后转移到准备好的15 ml塑料离心管中。加入333 μl DMSO，轻柔地上下颠倒混匀。
   3.5

   将待冻存的细胞按1 ml/管分装到准备好的冻存管中，写明传代次数和冻存时间，放入程序降温盒置于-80 °C超低温冰箱中，等待12小时。
   3.6

   将细胞转移到液氮中保存。

注意事项

1. 细胞增殖缓慢—如果是接种量较低引起的，可以加大接种量；如果没有可接种的细胞，可以3天更换一次新鲜的培养基，等待细胞增殖到合适的密度再进行传代；如果有其他增殖良好的细胞，可以将增殖良好的细胞孔中的培养基吸出，以0.22 μm滤器过滤，将过滤过的培养基加入到该增殖缓慢的细胞孔中。
2. 细胞传代次数过多—复苏细胞。
3. 细胞接种量太小—加大接种量。
4. 细胞营养不良：细胞传代次数不多，形态正常，但是增殖缓慢且转染效率低—适当增加培养基中胎牛血清的含量。
   

溶液配方

1. 细胞培养基
   89% Schneider果蝇培养基
   10%胎牛血清
   1%青链霉素
   
   培养基的配制方法：
   
   1)

   室温化冻胎牛血清。建议将化冻后的胎牛血清按50 ml/管分装到50 ml塑料离心管中，保存在-80 °C，以便之后的化冻
   2)

   室温化冻青链霉素混合液。建议将青链霉素混合液按10 ml/管分装到15 ml塑料离心管中，保存在-20 °C，以便之后使用
   3)

   准备一次性无菌过滤装置一个，连接真空泵。向该装置中加入5 ml青链霉素混合液和50 ml胎牛血清。加入Schneider果蝇培养基使液体总体积为500 ml
   4)

   打开真空泵，待液体过滤完之后关闭真空泵。过滤好的培养基放入4 °C冰箱保存
   5)

   在使用培养基进行实验之前需要将其预热到室温

致谢

本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。

参考文献

1. Schneider, I. (1972). Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol 27(2): 353-365.