产品名称：KAPA DNA HyperPlus (PCR-free) 文库构建试剂盒 (Roche Cat.No：07962436001)
实验名称：一个野生玉米RIL群体全基因组结构变异分析

研究背景

基因组结构变异会对基因的表达和生物个体的性状表现产生直接的影响，通过高通量测序分析野生玉米RIL群体的全基因组结构变异，以动态的分析基因组变异，遗传多样性，为选择目标基因研究玉米重要的农艺性状提供数据基础。
生物材料：玉米叶片基因组DNA
起始DNA量：500 ng (Qubit定量)

实验目的

利用KAPA DNA HyperPlus构建二代测序文库，分析野生玉米RIL群体全基因组结构变异。

关键词：玉米，二代测序，文库构建，全基因组分析

实验步骤

一．建库前准备

1. 起始DNA质控：1%琼脂糖电泳检测：DNA溶于超纯水（确保DNA中无EDTA），完整性好，主带清晰，无降解，无明显RNA、蛋白质污染（否则需要进行纯化）。示例见图1：
   
   
   图1. DNA质检电泳图
   
   
2. 所有涉及到酶的反应，宜在冰上操作（强调：连接adapter的步骤必须在冰上操作）。
3. 试剂提前解冻，解冻完毕置于冰上，解冻好的试剂宜适当混匀并简短离心，不得剧烈涡旋。用完后立马放回原处（DNA ligase现用现取，用完立马放回冰箱保存）。
4. 需用KAPA Pure beads时，提前从4 °C取出，置于室温下至少30 min。
5. 推荐用品：
   1) 磁力架 (Thermo Fisher，规格及货号: Magnetic Stand-96，AM10027)
   2) PCR板 (Axygen，规格及货号: PCR MICROPLATE，PCR-96-FLT-C)
   3) 封板膜 (Bio-Rad，规格及货号: Microseal B seal，MSB-1001)

1. 酶切片段化
   1.1

   体系：加试剂直接加到管底 
   
   用移液器上下轻缓吸打8-10次混匀，避免产生气泡，贴膜（microseal B seal）后进行反应。
   
   
   1.2

   程序：
   PCR仪热盖设置为50 °C:
   4 °C，2min
   37 °C，12min
   4 °C，Hold
   1.3

   反应结束后，取出放冰上，立马进行下一步操作。
   
   
2. 末端修复与加A尾
   2.1

   体系：加试剂直接加到管底
   
   用移液器上下轻缓吸打8-10次混匀，避免产生气泡，贴膜（microseal B seal）后进行反应。
   
   
   2.2

   程序：
   PCR仪热盖设置为85 °C:
   65 °C，30min
   4 °C，Hold
   2.3

   反应结束后，取出放冰上，立马进行下一步操作。
   
   
3. 接头连接
   3.1

   体系：加试剂直接加到管底
   
   用移液器上下轻缓吸打8-10次混匀，避免产生气泡，贴膜（microseal B seal）后进行反应。
   
   
   3.2

   程序：
   PCR仪热盖设置为40 °C，
   20 °C，15 min
   3.3

   反应结束后，取出放冰上，立马进行下一步操作。
   
   
4. 连接后产物纯化与片段选择
   4.1

   纯化 

   1)

   去除膜，务必注意防止液体溅出，造成样品交叉污染。

   2)

   涡旋KAPA Pure Beads，使之完全分散均匀（首先确保产物体积为110μl不够用Tris-HCl（10 mM， pH8.0-8.5) 补齐到110 μl）。

   3)

   分别加88 μl充分混匀的磁珠到反应样品中，用移液器上下吸打10次至充分混匀，然后室温下放置7min。

   4)

   将样品板放到磁力架上，放置10min或者直到液体澄清，小心吸出上清液，丢掉。

   5)

   分别加180 μl混合均匀的现配的80%乙醇，注意不得冲散磁珠。30 s后，去除所有上清液。

   6)

   重复操作步骤 5）一次，确保吸尽上清液。

   7)

   让样品板继续置于磁力架上，干燥磁珠，5-15 min（强调：不得让磁珠过于干燥，一旦发现磁珠有裂开的痕迹，立马进行洗脱）。

   8)

   从磁力架上取下样品板，用55 μl Tris-HCl (10 mM，pH8.0-8.5) 重悬磁珠，用移液器上下轻缓吸打10次混匀，并让所有液体置于底部，尽量避免挂壁。

   9)

   室温放置4 min后，将样品板置于磁力架上，5 min之后或者直到液体澄清，然后转移50 μl上清液到新的PCR板中，以备下一步反应。
   
   
   4.2

   片段选择

   1)

   分别加30 μl充分混匀的KAPA Pure Beads到反应样品中，用移液器上下吸打10次至充分混匀，然后室温下放置7 min。

   2)

   将样品板放到磁力架上，放置10 min或者直到液体澄清。

   3)

   小心吸出80 μl上清液并转移至新的PCR板中，吸取过程中枪头不得碰触磁珠。

   4)

   涡旋混匀KAPA Pure Beads并吸取10 μl至上清液中，用移液器上下吸打10次至充分混匀，然后室温下放置7 min。

   5)

   将样品板放到磁力架上，放置10 min或者直到液体澄清，小心吸出上清液，丢掉。

   6)

   分别加180 μl混合均匀的现配的80%乙醇，注意不得冲散磁珠。30 s后，去除所有上清液。

   7)

   重复操作步骤 6）一次，确保吸尽上清液。

   8)

   让样品板继续置于磁力架上，干燥磁珠，5-15 min（强调：不得让磁珠过于干燥，一旦发现磁珠有裂开的痕迹，立马进行洗脱）。

   9)

   从磁力架上取下样品板，用25 μl Tris-HCl（10 mM， pH8.0-8.5）重悬磁珠，用移液器上下轻缓吸打10次混匀，并让所有液体置于底部，尽量避免挂壁。

   10)

   室温放置4 min后，将样品板置于磁力架上，5min之后或者直到液体澄清，然后转移23 μl上清液到新的PCR板中，以备下一步反应。

实验结果

琼脂糖电泳检测构建文库

1. 样品制备：3 μl library + 1 μl 1× loading buffer
2. 电泳条件：1.5%琼脂糖，120 V，15 min，2 K plus ladder（100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1000 bp，2000 bp，3000 bp，5000 bp）
3. PCR-free文库，琼脂糖电泳显示文库片段大小会大于实际片段大小，见图2。
   
   
   图2. PCR-free文库质检电泳图
   

用户使用心得

1. 本试剂盒操作方便，步骤简化，节约时间。本人纯手工操作，有10小时建好192个文库的案例；
2. 本试剂盒对DNA起始量要求宽松，适用广泛，本人验证过从0.5 ng-2 μg之间投入起始量的建库，出库质量良好（50 ng以下样本有增加PCR扩增步骤）；
3. 本试剂盒每步反应体系较大，可以灵活优化实验体系，更好控制成本。