微型节肢动物的高质量DNA提取与全基因组扩增

研究背景

        近年来，高通量测序技术的发展以及成本的降低，极大地促进了分子生物学技术在各领域的广泛应用 (潘孝明等，2014)。然而，大多数高通量测序需要足量高质量的基因组DNA作为起始材料。由于样品的来源、固有特性和保存条件等限制，导致可供分析使用的DNA难以满足要求。在一些实际应用中，起始材料量非常有限，例如胚胎植入前遗传学诊断仅使用1-2个胚胎细胞进行分析检测 (Harper and Sengupta, 2012)，法医鉴定中只有痕量DNA样品 (蔡海强等，2011)；此外，在使用古生物学或福尔马林、固定石蜡包埋处理的标本时，样品处理方式和存储条件也可能会降低现有DNA的质量和浓度 (Czyz et al., 2015)。在微型节肢动物生物学研究中同样存在这些限制，标本数量、体型以及保存的方式对于分子生物学而言都不理想，尤其是一些珍贵的老标本。在这些情况下，只能对有限数量的遗传标记进行评估，直接分析样本的基因组DNA在技术上具有挑战性。
        为了能利用现代分子生物学技术全面分析这些样本，基因组DNA可以通过扩增的方式提高其产量 (Long et al., 2020)。全基因组扩增技术经过近30年的发展，已经相当成熟，克服了传统PCR方法出现的非特异扩增和扩增偏向性。多重置换扩增技术 (multiple displacement amplification, MDA) 能够对有限的样品进行快速、均匀、无偏向性的全基因组位点扩增，能够确保基因组高覆盖度，量化拷贝数。全基因组扩增的前提是从来源有限的样本材料中尽可能多地获取高质量的起始DNA模板，因此基因组DNA的提取质量也是极其关键的一步。
        本文提供了详细的基因组DNA提取和全基因组扩增方案的实验流程，有助于初学者短时间内掌握。该方案已在节肢动物多个门类 (如弹尾纲、缨翅目、虱目、膜翅目、蜱螨目) 中应用，其有效性已在弹尾纲的分子系统学研究中得以验证，详细结果请参阅Sun et al., 2020。

材料与试剂

1. QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN，catalog number: 56304，15-25 °C储存，保质期1年)
   
2. QIAGEN REPLI-g UltraFast Mini Kit (QIAGEN，catalog number: 150033，-20 °C储存，保质期3年)
   
3. QIAGEN REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN，catalog number: 150343，-20 °C储存，保质期半年)
   
4. 50x TAE缓冲液 (Solarbio，catalog number: T1060-500，室温储存，保质期1年)
   
5. 琼脂糖 (BBI，catalog number: A600014-0060，室温储存，保质期5年)
   
6. 核酸染料 (BBI，catalog number: A606696-0600，2-8 °C储存，保质期2年)
   
7. λ/HindIII DNA Marker (Novoprotein，catalog number: dm011-01b，4 °C保存3个月，-20 °C保存2年)
   
8. Qubit dsDNA BR检测试剂盒 (Invitrogen，catalog number: Q32850，2-8 °C冰箱中避光保存)
   
9. Qubit dsDNA HS分析试剂盒 (Invitrogen，catalog number: Q32851，2-8 °C冰箱中避光保存)
   

仪器设备

1. 高压灭菌锅 (松下健康医疗器械柱式会社 (日本制造)，catalog number: MLS-3781L-PC)
   
2. 真空离心浓缩仪 (博然科仪有限公司，catalog number: RVC2-25CD Plus)
   
3. 电泳仪 (北京六一仪器厂，catalog number: DYCP-31DN)
   
4. 超纯水制机 (昆山总督机械有限公司，catalog number: MUL9000(A)-H-20)
   
5. 制冰机 (SNAYO，catalog number: SYM-F140AY65)
   
6. 凝胶紫外成像系统 (上海欧翔科学仪器有限公司，catalog number: Gelx 1650)
   
7. 烘箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司，catalog number: DH6-9073658-Ⅲ)
   
8. PCR仪 (Alpha Thermal Cycler，catalog number: AC196)
   
9. Qubit荧光定量计 (Invitrogen，catalog number: Q33216)
   
10. 超净工作台 (上海沪静医疗器械有限公司，catalog number: VD-850)
    
11. 金属浴仪器 (杭州龙扬科学仪器有限公司，catalog number: HB10)
    
12. 数显恒温水浴锅 (金坛市杰瑞尔电器有限公司，catalog number: HH-2)
    
13. 3 μl、10 μl、20 μl、100 μl、200 μl、1 ml移液器 (BIOHIT，catalog number: 12662158)
    
14. 微波炉 (广东格兰仕微波生活电器制造有限公司，catalog number: P70D20N1P-G5(WO))
    
15. -20 °C冰箱 (中科美菱低温科技股份有限公司，catalog number: DW-YL270)
    
16. 普通4 °C冰箱 (美的集团电冰箱制造 (合肥) 有限公司，catalog number: BCD-283UTM6)
    
17. 旋涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司，catalog number: VORTEX-5)
    
18. 离心机 (长沙湘智离心机仪器有限公司，catalog number: TGL-20MB)
    
19. 电子天平 (塞多利斯科学仪器 (北京) 有限公司，catalog number: 00000246)
    

实验步骤

首先，我们提取样品DNA，然后对DNA总量进行测定，对于浓度过低或总量无法满足测序要求的DNA模板进行全基因扩增。为了尽量减少污染，所有实验耗材都必须在实验前进行高温灭菌后烘干待用，严格佩戴手套、口罩，所有实验操作均在超净工作台中完成。
一、 DNA提取
对于微型节肢动物的DNA提取，我们推荐使用试剂盒QIAamp DNA Micro Kit (catalog number: 56304)，该试剂盒可以从痕量样本中提取并纯化基因组DNA和线粒体DNA，有效提高获取的DNA质量和总量。本文以微型节肢动物为例，介绍DNA提取、开始前准备事项和其他注意要点。具体实验步骤可以参阅试剂盒操作手册https://www.qiagen.com/cn/resources/resourcedetail?id=085e6418-1ec0-45f2-89eb-62705f86f963&lang=en。

1. 取完整个体或部分组织于1.5 ml的离心管中。
   注意：对于外壳坚硬的样品，建议液氮冷冻研磨后进行实验，以确保基因组DNA充分提取。
   
2. 立即加入180 μl的Buffer ATL，并稳定至室温 (15-25 °C)。
   
3. 向离心管中加入20 μl的Proteinase K，旋涡混合器震荡涡旋15 s充分混匀。
   
4. 将1.5 ml离心管置于56 °C金属浴锅中4-6 h，为了更好的提取效果可以适当延长时长，甚至过夜，直至个体表皮透明或样品完全溶解。
   
5. 加入200 μl Buffer AL，盖好离心管盖，旋涡混合器震荡涡旋15 s充分混匀。
   注意：为了保证有效的裂解，必须对样品和缓冲液进行充分混合以得到均匀的溶液。
   
6. 加入200 μl乙醇 (95%或无水乙醇)，盖好离心管盖，通过旋涡混合器震荡涡旋15 s彻底混匀，并在室温 (15-25 °C) 下静置5 min。
   注意：如果室温超过25 °C，可以事先将乙醇在冰上冷却。
   
7. 简单离心1.5 ml的离心管，以移除吸附在盖子内的液滴。
   
8. 将吸附柱放入收集管中，用1 ml移液枪细心将步骤7中全部裂解溶液转移到带有2 ml收集管的吸附柱中，避免弄湿边缘。盖上盖子，以6,000 × g离心1 min，舍弃装有废液的收集管，将吸附柱置于干净的2 ml收集管中。
   注意：如果提取后需要保留残留的组织虫壳，我们可以在转移裂解溶液时把虫壳 (通常近乎透明) 留在原1.5 ml的离心管中，加入适量75%的乙醇，–20 °C保存，以备后续形态学研究需要。如果离心后裂解溶液没有完全通过膜，再次以更高的转速离心到吸附柱内无液体。
   
9. 小心地打开吸附柱，加入500 μl Buffer AW1，避免弄湿边缘。盖上盖子，以6,000 × g离心1 min，舍弃装有废液的收集管，将吸附柱置于干净的2 ml收集管中。
   
10. 小心地打开吸附柱，加入500 μl Buffer AW2，避免弄湿边缘。盖上盖子，以6,000 × g离心1 min，再次舍弃装有废液的收集管，将吸附柱置于干净的2 ml收集管中。
    注意：避免吸附柱和收集管中废液之间的接触。
    
11. 全速20,000 × g离心3 min以完全干燥膜，避免乙醇洗脱液的带入干扰一些下游应用。
    
12. 将吸附柱置于干净的1.5 ml离心管中，并丢弃装有废液的收集管。小心打开吸附柱的盖子，并将20-100 μl Buffer AE或蒸馏水加到膜的中心。
    注意：如果高pH或EDTA影响敏感的下游应用，请使用超纯水进行洗脱。确保Buffer AE或蒸馏水为室温 (15-25 °C)。如果洗脱体积< 50 μl，将Buffer AE或者超纯水添加到膜的中心，以确保完全洗脱DNA。吸附柱可以灵活选择洗脱体积，可以根据下游应用 (如DNA浓度) 的要求选择适当的体积。洗脱液的体积将比添加到吸附柱中的溶液体积少5 μl。
    
13. 盖上盖子，室温 (15-25 °C) 静置1 min。高速20,000 × g离心1 min。
    注意：离心前，将装有Buffer AE或蒸馏水的吸附柱在室温下静置5 min，通常有利于提高DNA产量。
    
    

二、 DNA检测
浓度测量：利用Qubit 3.0荧光定量计和Qubit dsDNA HS分析试剂盒 (catalog number: Q32851) 测定核酸量，以判断DNA获取总量是否满足公司测序初始模板要求。
        常规PCR检测 (可选) ：为了进一步确认物种以及分析需求，如使用条形码序列用于物种鉴定，我们可以选取单个基因片段进行PCR扩增、凝胶电泳、Sanger测序、序列拼接、比对等。

三、 DNA浓缩
对于DNA浓度极低的样品，我们推荐使用真空离心浓缩仪快速浓缩DNA以提高扩增的初始DNA模板浓度和全基因组扩增的成功率。真空离心浓缩仪的相关设置：50 μl DNA，30 °C，离心浓缩约2 h可获得干燥的DNA。

四、 全基因组扩增
QIAGEN REPLI-g UltraFast Mini Kit和Qiagen REPLI-g Single Cell Kit都是基于多重置换扩增技术，可对有限的DNA模板进行快速、均匀、无偏向性的全基因组扩增。然而，两个试剂盒的适用性不同。QIAGEN REPLI-g UltraFast Mini Kit针对> 10 ng的基因组DNA模板进行全基因组扩增，一个反应通常会产生7-10 μg的DNA，使用低质量的DNA通常会降低产量，在我们的经验中，对于< 10 ng的基因组DNA模板使用该试剂盒进行全基因组扩增均失败。Qiagen REPLI-g Single Cell Kit对于真核DNA可以使用较小量的DNA (1-10 ng，经验表明可以更低量) 进行扩增，甚至对于细菌10-100 pg DNA，也能产出高达40 μg的DNA。考虑到单个样本全基因组扩增成本 (QIAGEN REPLI-g UltraFast Mini Kit 110元/样，Qiagen REPLI-g Single Cell Kit 265元/样)，对于总DNA量低于50 ng和10 ng的样品可以分别由试剂盒QIAGEN REPLI-g UltraFast Mini Kit和Qiagen REPLI-g Single Cell Kit进行全基因组扩增。实验开始前准备事项和其他注意要点也可以参阅试剂盒操作手册：https://www.qiagen.com/mx/resources/resourcedetail?id=dad149da-3f86-4f74-8293-6e2b7f13dd38&lang=en，https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=38faca1c-64b0-4281-aab3-aa8324bbd181&lang=en，具体扩增流程如下：

QIAGEN REPLI-g UltraFast Mini Kit

1. 准备足够的UMK Buffer D1 (组分见表1) 和UMK Buffer N1 (组分见表2)，用于整个基因组的扩增反应。
   注意：UMK Buffer D1和UMK Buffer N1储存时间不超过3个月，表1和表2中给出的总体积适用于多达40个反应。
   
   表1. UMK Buffer D1的制备
   

   组分	体积
   Reconstituted Buffer DLB	5 μl
   Nuclease-free water	35 μl
   总体积	40 μl

   
   表2. UMK Buffer N1的制备
   

   组分	体积
   Stop solution	8 μl
   Nuclease-free water	72 μl
   总体积	80 μl

   
   
2. 向浓缩的DNA模板中加入1 μl超纯水。
   注意：模板DNA的量应大于10 ng。
   
3. 添加1 μl的UMK Buffer D1到DNA中。短暂地旋涡混合并离心。
   
4. 将样品在室温 (15-25 °C) 下静置3 min。
   
5. 添加2 μl的UMK Buffer N1到样品中。短暂地旋涡混合器并离心。
   
6. 在冰上溶解REPLI-g UltraFast DNA Polymerase。在室温下解冻所有其他组分，然后快速离心。
   注意：REPLI-g UltraFast DNA Polymerase解冻后可形成沉淀。沉淀可以通过10 s涡旋溶解。
   
7. 根据表3在冰上准备预混合液，并短暂的旋涡混合并离心。
   注意：预混合液应始终保持在冰上，并立即添加REPLI-g UltraFast DNA Polymerase。
   
   表3. 预混合液的制备
   

   组分	体积
   REPLI-g UltraFast Reaction Buffer	15 μl
   REPLI-g UltraFast DNA Polymerase	1 μl
   总体积	16 μl

   
   
8. 添加16 μl的预混合液到步骤5中的4 μl变性DNA中。
   
9. 将装有DNA的离心管放置于金属浴中30 °C保持1.5 h。
   
10. 金属浴65 °C保持3 min使REPLI-g UltraFast DNA Polymerase灭活。
    注意：如果扩增的DNA要用于PCR分析，失活后的DNA在水或TE Buffer中稀释为1:25 (如2 μl DNA + 48 μl水/TE Buffer)。每个PCR用2-3 μl稀释的DNA。
    
11. -20 °C储存扩增的DNA。
    
    

QIAGEN REPLI-g Single Cell Kit

1. 按照配方制备足够的SCK Buffer D1和SCK Buffer N1用于全基因组扩增反应 (表4和5)。
   注意：表4和5中给出的SCK Buffer D1和SCK Buffer N1的总体积足以用于12个反应。如果进行较少的反应，请将剩余的SCK Buffer D1和SCK Buffer N1存储在-20 °C。SCK Buffer D1和SCK Buffer N1不得储存超过3个月。
   
   表4. SCK Buffer D1的制备
   

   组分	体积
   Reconstituted Buffer DLB	7 μl
   Nuclease-free water	25 μl
   总体积	32 μl

   
   表5. SCK Buffer N1的制备
   

   组分	体积
   Stop Solution	9 μl
   Nuclease-free water	51 μl
   总体积	60 μl

   
   
2. 向浓缩的DNA模板中加入2.5 μl超纯水。
   
3. 向DNA中加入2.5 μl SCK Buffer D1。涡旋混合后，短暂离心。
   
4. 在室温下静置3 min。
   
5. 加入5.0 μl SCK Buffer N1。通过涡旋混合和离心后，存放在冰上。
   
6. 在冰上解冻REPLI-g sc DNA Polymerase。在室温下解冻所有其他组分，涡旋，然后短暂离心。
   注意：REPLI-g sc DNA Polymerase可在解冻后形成沉淀。通过涡旋10 s将沉淀溶解。
   
7. 根据表6准备预混合液，涡旋混匀并短暂离心。
   注意：按照表6中列出的顺序添加预混合液组分。加入超纯水和REPLI-g sc Reaction Buffer后，短暂涡旋混合、离心后，再添加REPLI-g sc DNA Polymerase。要准备用于多个反应的预混料，请根据反应数增加10%的配料。预混料应该保持在冰中，并在添加了REPLI-g sc DNA Polymerase后立即使用。
   
   表6. 预混合液的制备
   

   组分	体积/反应
   H2O sc	9 μl
   REPLI-g sc Reaction Buffer	29 μl
   REPLI-g sc DNA Polymerase	2 μl
   总体积	40 µl

   
   
8. 添加40 μl预混合液到10 μl来自步骤5的变性DNA中。
   
9. 金属浴30 °C反应8 h。
   注意：可根据下游分析DNA需求量控制反应时间，能满足高通量测序要求即可，不必过度扩增，金属浴16 h可获得最大DNA产量约40 μg。
   
10. 金属浴65 °C下3 min使REPLI-g sc DNA Polymerase失活。
    
11. 扩增的DNA可以在4 °C进行短期保存 (不超过一周) 或-20 °C保存进行长期保存。
    注意：扩增的DNA应作为基因组DNA，建议存储浓度至少为100 ng/μl。
    
12. 根据制造商的说明，使用合适体积的水或TE Buffer稀释扩增的DNA。如果进行PCR分析，则将扩增的DNA按1:100的比例稀释，并为每个PCR反应使用2 μl稀释的DNA。
    
    

五、 浓度测量
利用Qubit 3.0荧光定量计和Qubit dsDNA BR检测试剂盒 (catalog number: Q32850) 测定全基因组扩增后的核酸量。

六、 凝胶电泳
使用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测全基因组扩增产物，通过与marker比对，在紫外光下查看条带的亮度与长度。

七、 储存或送测
最终的全基因组扩增产物可以储存于-20 °C冰箱或直接干冰运输送测。

数据分析

本方案中，我们随机选取了以往实验中弹尾纲、膜翅目、缨翅目的部分样品，通过检测10种昆虫全基因组扩增前、后DNA浓度差异 (表7)，可以看出该流程全基因组扩增效果显著。其中，弹尾纲物种通过全基因组扩增后，通过DNA高通量测序数据进行基因组的组装、BUSCO完整性评估以及分子系统学研究进一步证明了该方案的有效性 (相关数据详见Sun et al., 2020)，适用于微型节肢动物系统发育等生物学研究。

表7. 已有研究效果一览表

致谢

感谢国家自然科学基金项目 (31970434、31772491) 的资助。

竞争性利益声明

作者声明没有利益冲突。

参考文献

1. 蔡海强，柳海涛，李安，唐文如，罗瑛. (2010). 全基因组扩增技术及其在法医个体识别中的应用. 遗传 32(11): 1119-1125.
2. 潘孝明，梁兴国. (2014). 全基因组扩增技术原理及研究进展. 生物技术通报 12: 47-54.
3. Harper, J. C. and Sengupta, S. B. (2012). Preimplantation genetic diagnosis: state of the art 2011. Hum Genet 131(2): 175-186.
4. Czyz, Z. T., Kirsch, S. and Polzer, B. (2015). Principles of whole-genome amplification.Methods Mol Biol 1347: 1-14.
5. Long, N., Qiao, Y., Xu, Z. Tu, J. and Lu, Z. (2020). Recent advances and application in whole-genome multiple displacement amplification. Quant Biol 8: 279-294.
6. Sun, X., Ding, Y., Orr, M. C. and Zhang, F. (2020). Streamlining universal single‐copy orthologue and ultraconserved element design: a case study in Collembola. Mol Ecol Resour 20(3): 706-717.