RNA (环RNA) 的非同位素标记Northern blot

实验原理

在变性条件下将待检测的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与地高辛或其它标记物标记的RNA探针进行杂交检测 (图1)。


图1. Northern blot的实验原理

材料与试剂

1. 锥形瓶
2. 滤纸
3. 离心管
4. RNase-free枪头 (Biosharp)
5. MOPS (Sangon, catalog number: A620336)
6. Tris base (Sigma, catalog number: T1503)
7. borie acid (硼酸) (Sangon, catalog number: A500897)
8. NaCl (Sangon, catalog number: A610476)
9. sodium citrate (柠檬酸钠) (Sigma, catalog number: C7254)
10. maleic acid (Sangon, catalog number: A507085)
11. Tween 20 (Sangon, catalog number: A600560)
12. NaOH (Sangon, catalog number: A100583)
13. 0.5 M EDTA, pH 8.0 (Sangon, catalog number: B540625)
14. 37 % formaldehyde (甲醛) (Sangon, catalog number: A501912)
15. Agarose (Biowest, catalog number: A21813)
16. GelRed (Biosharp, catalog number: BS354B)
17. 2x loading buffer (Thermo, catalog number: R0641)
18. SDS (Sangon, catalog number: A600485)
19. Trizol (Life, catalog number:15596-026)
20. Nylon membranes (尼龙膜) (Roche, catalog number: 11417240001)
21. DIG RNA Labeling Kit (Roche, catalog number: 11175025910)
22. DIG Northern Starter Kit (Roche, catalog number: 12039672910)
23. 10x MOPS buffer (见溶液配方)
24. 10x TBE buffer (见溶液配方)
25. 20x SSC buffer (见溶液配方)
26. Washing buffer I (见溶液配方)
27. Washing buffer II (见溶液配方)
28. Maleic acid buffer (马来酸缓冲液)(见溶液配方)
29. Washing buffer (见溶液配方)
30. Detection buffer (见溶液配方)
31. 胶回收试剂盒 (OMEGA, catalog number: D2500-02)

仪器设备

1. 电泳槽 (上海天能)
2. 微波炉 (格力)
3. 电热恒温水浴锅 (上海培清)
4. PH计 (Bio-Rad)
5. 水平电泳槽 (上海天能)
6. 转膜槽 (上海天能)
7. 多功能PCR仪 (Thermo Fisher Scientific)
8. 杂交炉 (UVP)
9. 紫外交联仪 (UVP)
10. 化学发光成像仪 (GE Healthcare)
    

实验步骤

一、 制胶
目的基因的长度 < 1000 nt利用1.5 %的胶；长度 ≥ 1000 nt的利用1 %的胶。以下以1 %的Agarose胶为例。

1. 称取1 μg Agarose于锥形瓶中，加入43.5 ml RNase-free H₂O，在微波炉里加热至均匀透明，然后在水浴锅中冷却至55 °C。
2. 加入5 μl GelRed (10000x), 5 ml 10x MOPS buffer和1.5 ml 37 %甲醛溶液，混合均匀。
3. 在电泳槽中制胶 (甲醛有毒，应在通风橱中进行)，待凝胶半小时后使用 (图2)。
   
   
   
   
   图2. Agarose胶
   
   

1. RNA样本处理。把10 μg RNA样品与等体积的2x loading buffer 混合均匀，置于80 °C金属浴上变性10分钟，然后放于冰上静置。
2. 将处理好的RNA样品加入上样孔中，在1x MOPS buffer中，150 V的电压下，跑胶1 h。\
3. 把凝胶切去边缘，然后浸泡于大量的RNase-free H₂O中，轻轻摇荡去除多余的甲醛。
4. 将转膜用海绵、厚滤纸在预冷的0.5x TBE buffer (转膜缓冲液) 中充分浸湿，之后在转膜缓冲液中利用200 mA的电流恒流过夜转膜，转膜时间要求超过12小时 (视频1)。
   
   
   
   视频1.转膜
   

1. 探针的设计。对于环RNA的探针一般有两种，一种是针对环RNA的junction区域，另一种则是环RNA的非junction区域。针对线性RNA，包括mRNA和lncRNA，一般选择GC比例约50 %的区域。探针的长度在100到200 nt间。
2. 模板的制备。把T7启动子的序列 (TAATACGACTCACTATAGGG) 加到PCR引物的一端进行扩增，纯化后的PCR产物作为模板。
3. PCR产物的纯化
   PCR产物经过凝胶电泳后，切取相应大小的目的条带，根据胶回收试剂盒的protocol进行纯化PCR产物。
4. 非放射性探针的标记
   根据DIG RNA Labeling Kit的protocol进行操作。
   模板 1 μg
   Labeling mix 4 μl
   Transcription buffer 4 μl
   T7 RNA polymerase 2 μl
   加H₂O至20 μl
5. 37 °C放置4 h，然后加1 μl的DNase I 酶孵育15 min，消除线性的DNA模板，探针最后通过Trizol法进行纯化。

1. 将转好的膜用新鲜的2x SSC buffer洗涤一次，在紫外交联仪中进行紫外交联，然后在杂交炉中80 °C烘干1小时。
2. 将适量体积的DIG Easy Hyb buffer (DIG Northern Starter Kit中成分) 预热到60 °C，将膜放入杂交液中预杂交2小时。
3. 将100 pmol DIG-labeled RNA探针100 °C变性10分钟，然后放于冰上静置2 min，加入到适量体积的新鲜的DIG Easy Hyb buffer中。
4. 将预杂交的膜放入探针杂交液中，在杂交炉内45-68 °C杂交过夜。

1. 用足量的Washing buffer I在15-25 °C连续震荡洗膜两次，每次5分钟。
2. 用足量的Washing buffer I在45-68 °C连续震荡洗膜两次，每次15分钟。
3. 用适量的Washing buffer将膜漂洗5分钟。
4. 然后将膜置于10 ml 封闭溶液工作液 (10x封闭母液用Maleic acid buffer稀释成1x)中孵育1小时。
5. 10 ml封闭溶液工作液加入1 μl的Digoxigenin-AP抗体配成抗体工作液。将膜从封闭溶液工作液中取出，与新鲜的抗体工作液孵育1小时。
6. 用适量的Washing buffer连续洗膜两次，每次15分钟。然后将膜置于Detection buffer中5分钟。
7. 将膜取出，滴加CSPD ready-to-use发光底物, 在37 °C孵育1小时，最后在化学发光成像仪中检测成图 (图3)。首先，打开ImageQuant LAS 4000软件，等待数分钟，当CCD达到预设的温度后，即可进行成像 (曝光时间设置的是Auto, 灵敏度和分辨率选择的是standard)。
   
   
   图3. 环RNA circPAIP2的Northern blot (PAIP2 Northern blots原图发表于参考文献1)。

注意事项

1. 本实验中所使用的离心管，buffer均是RNase-free的。
2. 所有buffer均需要用0.22 μm的滤头进行过滤。
3. Agarose胶每孔的最大上样量是50 μg。
4. 10 % SDS请勿低温放置，易沉淀结晶。
   

溶液配方

1. 10x MOPS buffer
   41.8 g MOPS
   800 ml RNase-free H₂O
   用1 M NaOH调pH至7.0，加RNase-free H₂O至1000 ml
2. 10x TBE buffer
   108 g Tris base
   40 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
   55.2 g borie acid (硼酸)
   加RNase-free H₂O至1000 ml，搅拌溶解
3. 20x SSC buffer
   175.3 g NaCl
   88.2 g sodium citrate (柠檬酸钠)
   用1 M NaOH调pH至7.0，加RNase-free H2O至1000 ml
4. Washing buffer I
   10 ml 20x SSC
   1 ml 10 % SDS
   89 ml RNase-free H₂O
5. Washing buffer II
   2.5 ml 20x SSC
   1 ml 10 % SDS
   96.5 ml RNase-free H₂O
6. Maleic acid buffer (马来酸缓冲液)
   11.6 g maleic acid
   8.8 g NaCl
   900 ml RNase-free H₂O
   用1 M NaOH调pH至7.5，加RNase-free H2O至1000ml
7. Washing buffer
   100 ml Maleic acid buffer
   300 μl Tween 20
8. Detection buffer
   12.1 g Tris base
   5.8 g NaCl
   900 ml RNase-free H₂O
   用1 M NaOH调pH至9.5，加RNase-free H₂O至1000 ml
   

致谢

感谢中国科学技术大学生命学院陈亮副研究员对本方法建立提供的帮助，感谢单革教授实验室李景新博士生提供的视频。

参考文献

1. Wang X, Shan G. Nonradioactive Northern Blot of circRNAs. Methods Mol Biol. 2018; 1724:135-41.
2. Li Z, Huang C, Bao C, Chen L, Lin M, Wang X, et al. Exon-Intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat Struct Mol Biol. 2015; 22(3):256-64.