使用QIIME 2 2025.4分析微生物组16S rDNA基因和ITS扩增子测序数据

研究背景

微生物无处不在，从自然环境到极端环境，几乎生态系统都能发现它们的身影。微生物组是特定环境或生态系统中所有微生物及其遗传信息的总和[1]，它不仅深刻影响着环境和生态平衡[2]，还与人类健康[3]、农业发展[4]和环境保护[5]等方面密切相关。近年来，微生物组研究已成为生命科学领域的热点，相关研究文献的数量持续激增，反映了这一领域的重要性[6]和广泛关注。在微生物组研究中，扩增子分析作为一种高效且经济的技术，因其特定基因片段（如16S rDNA）进行分析的特性，在揭示微生物群落结构和多样性方面表现尤为突出。凭借成本低、特异性强、操作简便等优势[7]，扩增子分析已被广泛应用于环境微生物监测、医学微生物学、农业科学等多个领域[8]。
QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）[9]是扩增子数据分析的经典工具，自发表以来就因其易用性和高效性深受研究人员的青睐。然而，随着高通量测序技术的发展，数据体量迅速增加，传统的 QIIME已难以满足现代研究对计算性能和功能复杂性的要求。为了应对这些挑战，QIIME 2 [10]应运而生。QIIME 2在功能上全面升级，不仅保留了传统QIIME的优势，还提供了更强大的工具和流程来处理扩增子数据。其交互性分析功能和可视化能力显著提升了用户体验，同时保证了研究的可重复性。然而，由于 QIIME 2涉及的生物信息学知识较多，对缺乏经验的新手而言，仍存在一定的学习门槛。
本研究旨在提供一套基于 QIIME 2 2025.4 版本的标准化实验方案，针对微生物组 16S rDNA 基因扩增子测序数据的处理与分析。同时，该实验方案也属于EasyAmplicon扩增子分析流程[11]的一部分，EasyAmplicon的分析结果可导入QIIME 2 2025.4进行后续分析。该方案的核心原理包括以下几个关键步骤：
1. 数据导入
将原始测序数据以 QIIME 2支持的格式导入，以确保数据兼容性和分析的顺畅。
2. 去噪与特征生成
使用DADA2[12]等方法去除测序误差，生成高分辨率的特征（ASV，Amplicon Sequence Variants）。ASV 是单碱基分辨率的序列单位，比传统的OTU（Operational Taxonomic Units）分类方法更准确，能够反映微生物群落的真实组成。
3. 多样性分析
通过计算α多样性（如香农指数、观察物种数）和β多样性（如PCoA和NMDS分析）量化微生物群落的多样性和相似性，揭示不同样本之间的生态学差异。
4. 物种注释
利用分类学数据库（如SILVA或Greengenes），对ASV进行物种注释，解析群落组成，并挖掘潜在的功能信息。
5. 差异分析
通过统计学方法（如ANCOM或LEfSe），识别在不同实验组之间具有显著差异的微生物种类，探索其与环境因素或健康状态的关联。
通过以上步骤，本方案不仅能够高效完成扩增子数据的标准化处理，还为研究者提供了直观的结果可视化和交互式探索工具。本文还附有操作视频，对代码实现和关键分析步骤进行详细讲解，以帮助新手快速掌握QIIME 2的使用方法，为同行提供便捷的学习和参考资源。

仪器设备

1. (可选）推荐使用计算服务器（操作系统：Linux主流发行版本，如CentOS 8+/Ubuntu 22.04+；CPU：4核+；内存：16G+；硬盘：> 10 GB，且大于原始数据大小3倍），网络访问畅通。
2. 个人电脑推荐Windows 10系统，内存8G+。需先在应用商店中安装Linux子系统（如Ubuntu 24.04 LTS），然后安装QIIME 2 2025.4；也可使用VirtualBox虚拟机运行QIIME 2镜像，但效率较低不推荐使用；Mac系统可直接安装QIIME 2 2025.4。(可选）Windows用户远程访问服务器需安装XShell 8.0+或Putty等终端类软件，Mac使用系统内置终端即可远程访问计算服务器。
   

软件和数据库

软件及数据库介绍（视频1）

1. QIIME 2可运行的四种环境任选其一：Linux服务器（推荐，适合大数据）、Windows 10子系统Ubutnu 24.04 LTS（推荐，适合小数据）、Windows中VirtualBox虚拟机中运行Ubutnu 24.04 LTS（不推荐，小数据集且效率低）、Mac系统（不推荐，兼容性问题较多）
2. 软件管理器Miniconda3 Linux 64-bit（Python 3.10+）：https://docs.anaconda.net.cn/miniconda/miniconda-other-installer-links/
3. QIIME 2 [10]发行版 2025.4：https://docs.qiime2.org/2025.4/index.html
   Greengenes 2 [13] 分类器（参考序列和物种分类信息）：
   https://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/2022.10.backbone.full-length.fna.qza
   https://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/2022.10.backbone.tax.qza
   
4. 流程示例参考代码和结果文件详见：https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon/blob/master/qiime2/pipeline_qiime2.sh
5. (可选）远程文件传输工具WinSCP客户端6.5：https://winscp.net/eng/download.php
6. (可选）Windows远程访问服务器终端工具Xshell 8.0：https://www.xshell.com/zh/xshell/
7. (可选）R语言环境，下载适合自己系统的安装包（版本：4.4.3+）： https://www.r-project.org/ ，本次演示最新版R4.5.0下载安装。
8. (可选） R语言开发环境RStudio，用于执行流程，下载适合自己系统的安装包（版本：2024.12.1+563）： https://posit.co/download/rstudio-desktop/
   

软件安装和数据库部署

QIIME 2不支持在Windows系统下直接安装。我们主要介绍远程访问Linux服务器和Windows 10下安装Linux子系统并使用QIIME 2的两种方法，任选其一即可。
方法1. 远程访问Linux服务器：Windows/Mac用户安装WinSCP客户端，用于上传测序数据至服务器或数据中心，也可用于下载分析结果本地查看。Windows用户安装Xshell用于远程访问服务器并开展分析，Mac用户可使用系统自带Terminal中的ssh命令远程访问服务器。
方法2. Windows 10的1609以后的版本可以安装Linux子系统：开始→Microsoft Store→搜索“Ubuntu”→选择“Ubuntu 24.04 LTS”→安装。安装前的系统设置和常见问题请阅读《Windows10安装Linux子系统Ubuntu 20.04LTS》。安装成功后可以在开始中启动“Ubuntu 24.04 LTS”的命令行，也可选在RStudio中设置默认Terminal为“Bash（Windows Subsystem for Linux）”，打开新终端即可使用。
在Linux系统下，以Miniconda3软件和Python3虚拟环境安装QIIME 2流程；然后下载16S rRNA基因数据库，建立物种分类器（视频2）。
注： 下文代码行添加灰色底纹背景， 其中需要根据系统环境修改的部分标为蓝色。

1. 安装Miniconda3 Linux 64-bit（已安装请跳过） 
   
   wget -c https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
   bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
   ~/miniconda3/bin/conda init
   
   

2. Conda新建环境安装QIIME 2（原始链接）
   
   conda env create \
   --name qiime2-amplicon-2025.4 \

   --file https: raw.githubusercontent.com qiime2 distributions refs heads dev 2025.4 amplicon released qiime2-amplicon-ubuntu-latest-conda.yml
   
   备用链接
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/qiime2-amplicon-ubuntu-latest-conda.yml
   
   conda env create \
   --name qiime2-amplicon-2025.4 \
   --file qiime2-amplicon-ubuntu-latest-conda.yml
   
   检查是否安装成功
   
   conda activate qiime2-amplicon-2025.4

实验步骤

QIIME 2分析流程演示和讲解见视频3和视频4。

视频3. 数据导入、特征表、Alpha和Beta多样性分析（https://www.bilibili.com/video/BV1Cs7WzNEVQ/）

视频4. 物种组成、差异比较（https://www.bilibili.com/video/BV1Ps7WzKETS/）

开始分析前，我们应处于项目所在目录（如windows下C盘的qiime2目录为/mnt/c/qiime2） ，并启动软件所在的Conda环境。

mkdir -p qiime2-2025.4
cd qiime2-2025.4
conda activate qiime2-amplicon-2025.4

1. 准备和导入元数据和测序数据
   下载示例元数据供编写自己课题对应的元数据时作为参考
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/metadata.txt 
   
   通常测序公司会返回原始数据，如Illumina双端测序的文件，每个样本有一对文件。本文使用的数据来自发表于Science杂志关于拟南芥根系微生物组研究的文章[14]，GSA项目号为PRJCA001296。为方便演示流程的使用，我们从中选取三个组（每组包括6个生物学重复共18个样本），并且随机抽取了50,000对序列作为本教程的测试数据，该数据可以从中国科学院基因组研究所的原始数据归档库（Genome Sequence Archive, GSA, https://bigd.big.ac.cn/gsa/）[15]中按批次编号CRA002352搜索并手动逐个下载至seq目录。可选使用awk语言配合wget命令根据样本元数据中批次和样本编号批量下载至seq目录，代码如下。
   
   mkdir -p seq
   awk '{system("wget -c ftp://download.big.ac.cn/gsa/"$5"/"$6"/"$6"_f1.fq.gz -O seq/"$1"_1.fq.gz"）}' <(tail -n+2 metadata.txt）
   awk '{system("wget -c ftp://download.big.ac.cn/gsa/"$5"/"$6"/"$6"_r2.fq.gz -O seq/"$1"_2.fq.gz"）}' <(tail -n+2 metadata.txt）
   
   awk为Linux下的一种字符处理语言，可同时使用文本中的多个字段；使用system命令调用wget，实现根据列表批量下载、改名的功能。
   检查文件大小，确定是否下载完整或正常。
   
   ls -lsh seq
   
   接下来根据样本名和测序文件位置手动编写样本文件的索引列表（manifest），格式参考流程目录中示例manifest文件。可选使用awk语言根据metadata编写自动生成mainfest文件，实现全流程的可重复计算。
   
   awk 'NR==1{print "sample-id\tforward-absolute-filepath\treverse-absolute-filepath"} \
   NR>1{print $1"\t$PWD/seq/"$1"_1.fq.gz\t$PWD/seq/"$1"_2.fq.gz"}' \
   metadata.txt > manifest
   
   数据导入qiime2
   
   qiime tools import \
   --type'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
   --input-path manifest \
   --output-path demux.qza \br /> --input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2
   
   导入1G大小的fq文件用时需7分钟，本文中使用测试数据仅需34秒。
   注：QIIME 2的起始文件为每个样本1个或1对文件。对于混池测序末拆分样本的原始数据，需要使用QIIME[9]中的脚本进行拆分，或要求测序服务商提供拆分后的单样本fastq格式测序文件。
   
   通过运行 summarize 命令来查看数据的质量（表1）
   
   qiime demux summarize \
   --i-data demux.qza \
   --o-visualization demux.qzv
   
   表1. 拆分序列汇总计数(Demultiplexed sequence counts summary）

   分位数	正向	反向
   最小值（Minimum）	50000	50000
   中位数（Median）	50000.0	50000.0
   平均值（Mean）	50000.0	50000.0
   最大值（Maximum）	50000	50000
   总计（Total）	900000	900000

   
   

2. 生成特征表和代表序列
   DADA2是基于R语言编写的扩增子分析流程，可以实现扩增子序列去除测序噪音、错误和嵌合体，并挑选扩增序列变体（amplicon sequence variant, ASV）和生成特征表（feature table）的功能[12]。dada2 denoise-paired方法需要两个用于质量过滤的参数：--p-trim-left，截取左端低质量序列，用于切除低质量序列、barcode或引物，本文--p-trim-left参数根据示例数据引物长度设置；--p-trunc-len，序列截取长度，去除右端低质量序列，本文示例数据质量较好，所以--p-trunc-len参数设置为0。具体参数应根据序列引物长度、标签序列和质量高低进行设置。
   支持多线程加速，如测试平台96线程（p）环境下，可以使用--p-n-threads参数指定。不同线程下的计算时间（以分钟为单位，m）：
   0（使用全部）/96 p, 34 m；
   24 p, 44 m；
   8 p, 77 m；
   1 p, 462 m。
   
   time qiime dada2 denoise-paired \
   --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
   --p-n-threads 8 \
   --p-trim-left-f 29 --p-trim-left-r 18 \
   --p-trunc-len-f 0 --p-trunc-len-r 0 \
   --o-table dada2-table.qza \
   --o-representative-sequences dada2-rep-seqs.qza \
   --o-denoising-stats denoising-stats.qza
   
   可使用dada2结果并导入主流程，或可选从外部其他流程结果的特征表和代表序列进行导入继续分析，详见常见问题1。QIIME 2结果qza/qzv文中结果导出方法见常见问题2。
   
   cp dada2-table.qza table.qza
   cp dada2-rep-seqs.qza rep-seqs.qza
   
   统计特征表
   
   qiime feature-table summarize \
   --i-table table.qza \
   --o-visualization table.qzv \
   --m-sample-metadata-file metadata.txt
   
   结果qzv/qza文件可上传到https://view.qiime2.org/网站查看。QIIME的结果qza为数据文件，qzv为图表文件，本质上都是zip格式的压缩包，也可使用压缩软件解压查看内容，qzv解压的目录中包括分析结果的网页报告和相关的图表文件。我们先观察每个样本的测序量的总体概述表（表2），用于确定多样性分析的抽平标准化阈值，如本示例样本在特征表中使用的测序数据量最小值为27,059，即选择最小值；如果最小值和第一分位数差别特别大，则需要结合样本测序量和样本量分布图（图1） 选择最小值和第一分位数间的合适数值，尽量保留足够样本量的前提下选择较大的抽平阈值以使用更多的测序数据，注意低于阈值的样本将不会参与多样性分析。更多抽平阈值的交互式选择详见网页中“交互样本细节（Interactive Sample Detail）”页面。
   注：抽平阈值最小为1,000是基于早期454测序时代的标准，当前Illumina测序通量较大，最小值一般不小于5,000，推荐1万，且越大越好。
    
   表2. 每个样本的测序量（Frequency per sample）

   分位数	测序量
   最小值（Minimum frequency）	27,059
   第一分位数（1st quartile）	28,594
   中位数（Median frequency）	30,867.5
   第三分位数（3rd quartile）	32,861.5
   最大值（Maximum frequency）	34,667
   平均值（Mean frequency）	30,781.7

   
   
   图1. 样本可用测序量和样本量分布图。X轴表示样本的可用测序量，轴须线为样本所在位置；Y轴为样本量分布。本图可指导用户筛选合理的抽平阈值。
   
   统计代表序列
   
   qiime feature-table tabulate-seqs \
   --i-data rep-seqs.qza \
   --o-visualization rep-seqs.qzv
   
   结果可上传至https://view.qiime2.org/中查看（以qzv结尾的文件，我们接下来分析均默认在QIIME 2网页预览工具中查看，以后不再赘述），会显示序列长度统计，还有每个特征序列的ID、长度和序列，其中序列可以点击跳转NCBI BLAST显示比对结果。

3. Alpha和Beta多样性分析
   构建进化树用于多样性分析
   
   qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
   --i-sequences rep-seqs.qza \
   --o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
   --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
   --o-tree unrooted-tree.qza \
   --o-rooted-tree rooted-tree.qza
   
   多样性分析，低于重采样深度的样本将会丢弃，通常重采样深度会选择样本测序量最小值以保留较多样本，同时要兼顾保留总体测序量最大化。因此需要根据样本量、数据分布等实际情况选择适合的值尽量使数据利用率最大化，具体见上面table.qzv结果中交互式筛选页面的辅助筛选工具可用。本研究数据分布较均匀，最小值即为最优阈值。最后会在core-metrics-results目录生成4种常用Alpha和Beta多样性结果。
   
   qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
   --i-phylogeny rooted-tree.qza \
   --i-table table.qza \
   --p-sampling-depth 27059 \
   --m-metadata-file metadata.txt \
   --output-dir core-metrics-results
   
   

4. Alpha多样性组间显著性分析和可视化
   可选的alpha多样性指数有faith_pd、shannon、observed_features和evenness。faith_pd是综合物种间进化树信息的多样性指数[16,17]，shannon是综合丰度和均匀度的指数，observed_features是丰富度，evenness是均匀度，中文简介进一步阅读《Alpha多样性箱线图》，详细的介绍、计算方法和参考文献详见scikit-bio文档（http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.html）。此处以observed_features为例，在之前的版本中被称作observed_otus。
   
   index= observed_features
   qiime diversity alpha-group-significance \
   --i-alpha-diversity core-metrics-results ${index}_vector.qza \
   --m-metadata-file metadata.txt \
   --o-visualization core-metrics-results ${index}-group-significance.qzv
   
   查看core-metrics-results目录下observed_features-group-significance.qzv结果文件，包括各种多样性指数分布的箱线图（图2），和基于Kruskal-Wallis两两组较的p-value和q-value（表2），可以下载svg格式的矢量图和tsv格式的表格，还可以切换列（Column）探索不同分组方式下的分布和统计结果。
   
   
   图2. 各组Alpha多样性指数的箱线图分布。X轴为分组，Y轴为observed features多样性指数值，各组间统计的P-value值见表3。
   
   表3. Alpha多样性指数各组间比较的统计结果（Kruskal-Wallis pairwise）

   Group 1	Group2	H	p-value	q-value
   KO（n=6）	OE（n=6）	0.0231579	0.630356	0.630356
   KO（n=6）	WT（n=6）	6.610329	0.010139	0.030417
   OE(n=6）	WT（n=6）	3.705263	0.054241	0.081362

   
   

5. Alpha多样性稀释曲线

   max-depth参数通常调置为样本测序量最大值，如果最大值为异常值（outlier），可以在第三分位数和最大值间选择合适的值，请参考table.qzv结果选择。
   
   qiime diversity alpha-rarefaction \
   --i-table table.qza \
   --i-phylogeny rooted-tree.qza \
   --p-max-depth 34667 \
   --m-metadata-file metadata.txt \
   --o-visualization alpha-rarefaction.qzv
   
   结果alpha-rarefaction.qzv中有shannon, faith_pd和observed_otus三种Alpha多样性指数可切换，以展示各样本组随测序深度（Sequencing Depth） 增加对应多样性指数分布的箱线图，图例可点选实现控制分组显示开/关。

6. Beta多样性组间显著性分析和可视化
   可选的beta指数有unweighted_unifrac、bray_curtis、weighted_unifrac以及jaccard。UniFrac是结合特征间进化关系计算群落间距离的方法[18]，weighted和unweighted分别是指是否考虑特征的丰度权重。Bray-Curtis[19]是一种生态学常用的距离计算方法。Jaccard类似于非加权的Bray-Curtis距离。中文简介进一步阅读《Beta多样性PCoA和NMDS排序》，Unifrac的详细的介绍详见scikit-bio文档（https://www.osgeo.cn/scikit-bio/diversity.html） 。
   指定beta多样性指数和分组用于减少计算量，因为置换检验较耗时。
   
   distance=weighted_unifrac
   column=Group
   qiime diversity beta-group-significance \
   --i-distance-matrix core-metrics-results/${distance}_distance_matrix.qza \
   --m-metadata-file metadata.txt \
   --m-metadata-column ${column} \
   --o-visualization core-metrics-results/${distance}-${column}-significance.qzv \
   --p-pairwise
   
   此处可得到三个组别中的样本是否具有显著差异的分析结果，我们先查看core-metrics-results目录中的weighted_unifrac_emperor.qzv，颜色选择分组Group，此外还可以设置点的透明度、大小、形状等，确定图形样式后，在图右上角设置按钮选择“Save plot” — “SVG+Label”，可以保存主图和图例两个SVG格式的矢量图，发表时可使用矢量图编辑软件拼接（图3）。
   
   
   图3. 基于Weighted unifrac距离的主坐标分析图。图中展示前三轴，括号中为解析率。图中点代表样本，颜色对应分组信息，对应关系见右上角图例。
   
   再查看结果weighted_unifrac-Group-significance.qzv，有组间距离分布图（图4），还有组间成对permanova比较的结果（表3），可以看到各组间均存在显著差异（p-value < 0.05, q-value < 0.05） 。
   
   
   图4. 相对于WT组样本的Weighted Unifrac距离分布箱线图。WT组6个样本间非自身距离有15种（6 × 5 ÷ 2） ，而组间为36种（6 × 6）。组间的显著性检验结果见表4。
   
   表4. Beta多样性指数各组间比较的统计结果（PERMANOVA/ADONIS）

   Grou1	Grou2	Sample size	Permutations	pseudo-F	p-value	q-value
   KO	OE	12	999	3.680430	0.010	0.015
   KO	WT	12	999	3.982189	0.022	0.022
   OE	WT	12	999	2.744504	0.009	0.015

   
   

7. 物种组成分析
   训练分类器--全长（通用）
   下载参考序列和物种分类信息
   
   wget -c --no-check-certificate https://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/2022.10.backbone.full-length.fna.qza
   
   wget -c --no-check-certificate https://ftp.microbio.me/greengenes_release/2022.10/2022.10.backbone.tax.qza
   
   分类器训练，耗时2小时左右
   
   time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
   --i-reference-reads 2022.10.backbone.full-length.fna.qza \
   --i-reference-taxonomy 2022.10.backbone.tax.qza \
   --o-classifier classifier-full.qza 
   
   （可选）训练分类器—指定V区分类器
   使用与测试数据对应的V5（799F） - V7（1193R） 引物为例进行提取序列，耗时约6分钟。
   
   time qiime feature-classifier extract-reads \
   --i-sequences 2022.10.backbone.full-length.fna.qza \
   --p-f-primer AACMGGATTAGATACCCKG \
   --p-r-primer ACGTCATCCCCACCTTCC \
   --p-trunc-len 350 \
   --o-reads ref-seqs.qza
   
   基于筛选的指定区段，生成实验特异的分类器，耗时约30分钟。
   
   time qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
   --i-reference-reads ref-seqs.qza \
   --i-reference-taxonomy 2022.10.backbone.tax.qza \
   --o-classifier classifier_greengenes_V5-V7.qza
   
   物种注释使用classifier_greengenes_V5-V7.qza，也可以使用全长序列的训练集，耗时约2小时，具体时间由输入数据和数据库大小决定。如果你使用的研究非此引物，可以使用全长训练集，同时推荐使用实验中采用的引物训练特异的分类器应用于此，详见数据库部署。
   
   qiime feature-classifier classify-sklearn \
   --i-classifier classifier_greengenes_V5-V7.qza \
   --i-reads rep-seqs.qza \
   --o-classification taxonomy.qza
   
   可视化物种注释
   
   qiime metadata tabulate \
   --m-input-file taxonomy.qza \
   --o-visualization taxonomy.qzv
   
   结果文件taxonomy.qzv为交互式网页表格（图5），包括特征ID、分类注释结果和置信度3列，可以实现排序和查找等功能。
   
   
   图5. 物种注释信息
   
   堆叠柱状图展示（图6）
   
   qiime taxa barplot \
   --i-table table.qza \
   --i-taxonomy taxonomy.qza \
   --m-metadata-file metadata.txt \
   --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
   
   结果文件taxa-bar-plots.qzv为交互式网页图片（图6），如可以调整柱宽至中等，切换不同分类级别至Level2，修改配色方案为scheeDark2，按分组Group排序，再按Proteobacteria降序排列，然后保存SVG的柱状图和图例。也推荐保存表格的csv数据用于个性化绘图。
   
   
   图6. 堆叠柱状图展示样本门水平组成。图中按分组和变形菌门丰度依次排序。
   
   
8. 差异分析ancom
   格式化特征表，添加伪计数
   
   qiime composition add-pseudocount \
   --i-table table.qza \
   --o-composition-table comp-table.qza
   
   ancom[20]计算差异特征，指定分组类型比较，耗时约7 m。
   
   column=Group
   time qiime composition ancom \
   --i-table comp-table.qza \
   --m-metadata-file metadata.txt \
   --m-metadata-column ${column} \
   --o-visualization ancom-${column}.qzv
   
   结果ancom-Group.qzv用散点图显示显著差异的ASV（图7），在交互式图形页面中可直接看到显著差异ASV统计结果。本研究组间差异较小，仅有1个显著差异扩增序列变体（amplicon sequence variants ASV）为b46f62815f5bc0f8c18c3c374acabe23（ASV_672），在下图最右上角以红色标注，在taxonomy.qzv中查找其分类信息为d__Bacteria; p__Actinobacteriota; c__Actinomycetia; o__Mycobacteriales; f__Pseudonocardiaceae; g__Pseudonocardia。
   
   
   图7. 属水平ancom差异分析散点图
   
   

QIIME 2实用非核心插件

QIIME 2 微生物组分析功能可通过插件提供给用户。除QIIME 2 2025.4包含的微生物组分析使用的核心插件，QIIME 2论坛中还有一些实用的非核心插件，本文将重点介绍以下3个插件(Q2-picrust2、Q2-ITSxpress和Q2-FMT）的使用，更多相关插件详见表8。

q2-picrust2插件（功能预测）
用于运行 PICRUSt2 管道，以获得基于 16S 数据的 EC、KO 和 MetaCyc 通路预测[21]。EPA-NG或SEPP可用于将序列放入所需的参考系统发育中。本文将重点介绍如何运行SEPP，它占用的内存较少。

视频5. 运行q2-picrust2插件 (https://www.bilibili.com/video/BV1yp7WziEgx/)

1. 安装
   创建目录
   
   mkdir -p q2-picrust2-tutorial
   cd q2-picrust2-tutorial
   
   使用conda安装q2-picrust2（原始链接）
   
   conda env create --name q2-picrust2-amplicon-2024.5 --file https://raw.githubusercontent.com/picrust/q2-picrust2/refs/heads/master/environment-files/q2-picrust2-qiime2-amplicon-2024.5.yml
   
   备用链接
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/q2-picrust2-amplicon-2024.5.yml
   
   conda env create --name q2-picrust2-amplicon-2024.5 --file q2-picrust2-amplicon-2024.5.yml
   
   激活环境
   conda activate q2-picrust2-amplicon-2024.5
   
   
2. 下载PICRUSt2 教程中的测试文件
   
   wget -c http://kronos.pharmacology.dal.ca/public_files/picrust/picrust2_tutorial_files/mammal_biom.qza
   wget -c http://kronos.pharmacology.dal.ca/public_files/picrust/picrust2_tutorial_files/mammal_seqs.qza
   wget -c http://kronos.pharmacology.dal.ca/public_files/picrust/picrust2_tutorial_files/mammal_metadata.tsv
   
   这些文件对应于示例的ASV计数表、ASV序列和元数据。总共有11个样本和37个 ASV。这些样本是从北极狼、土狼、海狸和豪猪的哺乳动物粪便中收集的。
   
3. 功能预测
   创建临时目录并设置环境变量
   
   mkdir -p ~/tmp/qiime2_picrust2_temp
   export TMPDIR=~/tmp/qiime2_picrust2_temp
   
   运行SEPP
   
   qiime picrust2 full-pipeline \
   --i-table mammal_biom.qza \
   --i-seq mammal_seqs.qza \
   --output-dir q2-picrust2_output \
   --p-placement-tool sepp \
   --p-threads 8 \
   --p-hsp-method pic \
   --p-max-nsti 2 \
   --verbose
   
   输出结果文件有ec_metagenome.qza-EC 宏基因组预测、ko_metagenome. qza-KO宏基因组预测和pathway_abundance.qza-MetaCyc 通路丰度预测。
   

4. 使用此命令获取有关通路丰度文件的摘要信息（表5）
   
   qiime feature-table summarize \
   --i-table q2-picrust2_output pathway_abundance.qza \
   --o-visualization q2-picrust2_output pathway_abundance.qzv
   
   表5. 每个样本的频率(Frequency per sample）

   分位数	频率
   最小值(Minimum frequency）	236,866.9
   第一分位数(1st quartile）	286,826.5
   中位数(Median frequency）	374,069.1
   第三分位数(3rd quartile）	602,058.4
   最大值(Maximum frequency）	1,027,392
   平均值(Mean frequency）	474,321.1

   
   

5. 计算多样性指标
   
   qiime diversity core-metrics \
   --i-table q2-picrust2_output pathway_abundance.qza \
   --p-sampling-depth 236867 \
   --m-metadata-file mammal_metadata.tsv \
   --output-dir pathabun_core_metrics_out \
   --p-n-jobs 1
   
   查看结果pathabun_core_metrics_out/bray_curtis_emperor.qzv（图8），它显示了此数据集在食肉动物和啮齿动物之间的明显差异。
   
   
   图8. 基于Weighted unifrac距离的主坐标分析图

q2-ITSxpress插件（修剪 ITS 序列的保守侧翼区域）

用于快速修剪内部转录的间隔序列的软件，并具有标记基因分析的质量分数。ITSxpress通过获取FASTQ数据、反复制序列，然后使用HMMSearch 识别起始和终止位点[22]。分析结果并返回修剪后的文件。本文将介绍ITS工作流程的第一部分：
（1）使用ITSxpres修剪ITS区域
（2）使用DADA2或Deblur调用序列变体
（3）训练QIIME 2分类器
（4）按分类学对序列进行分类
在本教程中，我们将从两个双端样本开始，这两个样本已经拆分为正向和反向FASTQ文件。

视频6. 运行q2-ITSxpress插件（https://www.bilibili.com/video/BV1yp7WziE4L/）

1. 安装
   创建目录
   
   mkdir -p q2-ITSxpress-tutorial
   cd q2-ITSxpress-tutorial
   
   激活QIIME 2环境
   
   conda activate qiime2-amplicon-2025.4
   
   使用 Bioconda 安装 ITSxpress
   
   conda install -c bioconda itsxpress
   
   刷新插件
   
   qiime dev refresh-cache
   
   检查是否安装成功
   
   qiime itsxpress
   
   
2. 下载示例数据
   我们将使用来自两个土壤样品的数据，这些样品的ITS2区域已用真菌引物扩增。它们已被子采样到10,000个读取对，以便更快地处理。sample1_r1.fq.gz和sample1_r2.fq.gz；sample2_r1.fq.gz和sample2_r2.fq.gz；清单文件：manifest.txt和映射文件：mapping.txt。
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/sample1_r1.fastq.gz
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/sample1_r2.fastq.gz
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/sample2_r1.fastq.gz
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/sample2_r2.fastq.gz
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/manifest.txt
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/mapping.txt
   
   

3. 导入序列数据
   
   qiime tools import \
   --type SampleData[PairedEndSequencesWithQuality] \
   --input-format PairedEndFastqManifestPhred33\
   --input-path manifest.txt \
   --output-path sequences.qza
   
   通过运行 summarize 命令来查看数据的质量（表6）
   
   qiime demux summarize \
   --i-data sequences.qza \
   --o-visualization sequences.qzv
   
   表6. 拆分序列汇总计数(Demultiplexed sequence counts summary）

   分位数	正向	反向
   最小值（Minimum）	2500	2500
   中位数（Median）	2500.0	2500.0
   平均值（Mean）	2500.0	2500.0
   最大值（Maximum）	2500	2500
   总计（Total）	5000	5000

   
   

4. 使用ITSxpress修剪ITS样本
   
   qiime itsxpress trim-pair-output-unmerged\
   --i-per-sample-sequences sequences.qza \
   --p-region ITS2 \
   --p-taxa F \
   --p-cluster-id 1.0 \
   --p-threads 16 \
   --o-trimmed trimmed_exact.qza
   
   使用以下命令聚类 99.5% 的序列相似度。建议将聚类到100%相似性，因为速度优势可以忽略不计。
   
   qiime itsxpress trim-pair-output-unmerged \
   --i-per-sample-sequences sequences.qza \
   --p-region ITS2 \
   --p-taxa F \
   --p-cluster-id 0.995 \
   --p-threads 16 \
   --o-trimmed trimmed.qza
   
   

5. 使用 DADA2 识别序列变异
   
   qiime dada2 denoise-paired \
   --i-demultiplexed-seqs trimmed_exact.qza \
   --p-trunc-len-r 0 \
   --p-trunc-len-f 0 \
   --output-dir dada2out
   
   汇总数据以进行目视检查(表7）
   
   qiime feature-table summarize \
   --i-table dada2out table.qza \
   --o-visualization tableviz.qzv
   
   表7. 每个样本的频率(Frequency per sample）

   分位数	频率
   最小值（Minimum frequency）	848
   第一分位数（1st quartile）	862.2
   中位数（Median frequency）	876.5
   第三分位数（3rd quartile）	890.8
   最大值（Maximum frequency）	905
   平均值（Mean frequency）	876.5

   
   

6. 从UNITE下载用于真菌分类的参考数据
   原始下载链接
   
   wget -c https://s3.hpc.ut.ee/plutof-public/original/db1d6ddb-a35d-48c5-8b1a-ad9dd3310c6d.tgz
   
   备用下载链接
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/db1d6ddb-a35d-48c5-8b1a-ad9dd3310c6d.tgz
   
   解压
   
   tar -xzvf db1d6ddb-a35d-48c5-8b1a-ad9dd3310c6d.tgz
   
   将最新的UNITE数据导入QIIME 2
   
   qiime tools import \
   --type'FeatureData[Sequence]' \
   --input-path sh_refs_qiime_ver10_dynamic_04.04.2024.fasta \
   --output-path unite.qza
   
   qiime tools import \
   --type'FeatureData[Taxonomy]' \
   --input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat \
   --input-path sh_taxonomy_qiime_ver10_dynamic_04.04.2024.txt \
   --output-path unite-taxonomy.qza
   
   
7. 训练QIIME 2分类器，耗时1小时左右
   
   qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
   --i-reference-reads unite.qza \
   --i-reference-taxonomy unite-taxonomy.qza \
   --o-classifier classifier.qza
   
   

8. 对序列变体进行分类
   
   qiime feature-classifier classify-sklearn \
   --i-classifier classifier.qza \
   --i-reads dada2out representative_sequences.qza \
   --o-classification taxonomy.qza
   
   汇总结果
   
   qiime metadata tabulate \
   --m-input-file taxonomy.qza \
   --o-visualization taxonomy.qzv
   
   堆叠柱状图展示（图9）
   
   qiime taxa barplot \
   --i-table dada2out table.qza \
   --i-taxonomy taxonomy.qza \
   --m-metadata-file mapping.txt \
   --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
   
   
   图9. 堆叠柱状图展示样本门水平组成

   
   

q2-FMT插件（评估粪菌移植后的植入范围）
Q2-FMT是QIIME 2的一个插件，专门用于评估粪菌移植（FMT）后微生物组的定植程度(Herman 2024），其主要功能包括以下几个方面：
（1）评估嵌合不对称群落融合：通过分析受体微生物组与供体微生物组的融合情况，判断移植后的微生物组是否成功定植。
（2）识别供体微生物组指示特征：找出在受体中定植的供体微生物组特征，帮助了解哪些微生物在移植后能够在受体中存活并发挥作用。
（3）分析时间稳定性：研究移植后微生物组随时间的变化情况，评估其在受体中的稳定性和持久性。
本教程介绍该插件的安装及绘制云雨图了解受体与供体样本在粪菌移植（FMT）后如何变化，更多内容请参照https://q2-fmt.readthedocs.io/en/latest/tutorial/tutorial.html

1. 安装
   下载清单文件（原始链接）
   
   wget -c https://raw.githubusercontent.com/qiime2/q2-fmt/refs/heads/dev/environment-files/q2-fmt-qiime2-amplicon-2024.10.yml
   
   备用链接
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/q2-fmt-qiime2-amplicon-2024.10.yml
   
   conda新建环境安装
   
   conda env create --name q2-fmt-amplicon-2024.10 --file q2-fmt-qiime2-amplicon-2024.10.yml
   
   安装过程中遇到提示pip安装一个依赖项无法从GitHub下载q2-fmt的压缩包时，手动下载从本地安装
   
   wget -c http://www.imeta.science/db/qiime2/q2-fmt-2024.11.1.zip
   
   ~ miniconda3 envs q2-fmt-amplicon-2024.10 bin python -m pip install . q2-fmt-2024.11.1.zip
   
   激活环境
   
   conda activate q2-fmt-amplicon-2024.10
   
   
2. 下载元数据和特征表
   
   创建目录并进入
   
   mkdir q2-fmt-tutorial
   cd q2-fmt-tutorial
   
   数据下载
   
   wget -O 'sample-metadata.tsv' \
   'https: q2-fmt.readthedocs.io en latest data tutorial sample-metadata.tsv'
   wget -O 'feature-table.qza' \
   'https: q2-fmt.readthedocs.io en latest data tutorial feature-table.qza'
   
   汇总特征表
   
   qiime feature-table summarize \
   --i-table feature-table.qza \
   --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv \
   --o-visualization autofmt-table-summ.qzv
   
   
3. 计算多样性指标
   要开始我们的多样性分析，我们首先需要确定我们想要选择什么样的均匀采样深度（或“稀疏深度”）来计算我们的多样性指标。由于大多数多样性指标对不同样本的不同采样深度敏感，因此通常会将每个样本的计数随机子采样为特定值。
   
   qiime diversity core-metrics \
   --i-table feature-table.qza \
   --p-sampling-depth 10000 \
   --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
   --output-dir diversity-core-metrics
   
   

4. 绘制云雨图了解受体与供体的距离（图10）
   
   qiime fmt cc \
   --i-diversity-measure diversity-core-metrics jaccard_distance_matrix.qza \
   --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
   --p-distance-to donor \
   --p-compare baseline \
   --p-time-column timepoints \
   --p-reference-column DonorSampleID \
   --p-subject-column PatientID \
   --p-filter-missing-references \
   --p-against-group 0 \
   --p-p-val-approx asymptotic \
   --o-stats jaccard-raincloud-stats.qza \
   --o-raincloud-plot jaccard-raincloud-plot.qzv
   
   
   图 10. 受试者在不同时间点的“与供体样本ID的距离”测量值的分布情况
   
   在得到的云雨图中，我们看到在癌症治疗后（时间点0-2），受体与供体的距离相对较远。在FMT干预后（时间点3），受体与供体的距离变近了，两者的微生物组看起来更相似。我们看到这有一些稳定性，但到最后一个时间点，接受者的微生物组看起来大多与其捐赠的微生物组不同。
   
   表8. QIIME 2官网论坛实用插件

   名称	链接	简介	参考文献
   Q2-krona	https://forum.qiime2.org/t/q2-krona-plugin-for-creating-krona-plots/21294	Krona 是一个创建交互式多层饼图的工具	[23]
   Q2-SCRuB	https://forum.qiime2.org/t/q2-scrub-release/26609	SCRuB是一种概率计算机净化方法，它结合了多个样品和对照品之间的共享信息，以精确识别和去除污染物	[24]
   Q2-SCNIC	https://forum.qiime2.org/t/q2-scnic-a-tool-for-making-correlation-networks-finding-modules-of-observations-and-summarizing-them/6116	SCNIC是一种从特征表构建相关网络、查找所述网络中的模块并汇总这些模块的工具	[25]
   Q2-fondue	https://forum.qiime2.org/t/q2-fondue-plugin-for-meta-data-retrieval-from-sra/22595	用于从SRA检索（元）数据	[26]
   Q2-ITSxpress	https://forum.qiime2.org/t/q2-itsxpress-a-tutorial-on-a-qiime-2-plugin-to-trim-its-sequences/5780	用于修剪ITS序列，通过HMM图谱与侧翼保守基因的末端相匹配来修剪 FASTA 序列	[22]
   Q2-srs	https://forum.qiime2.org/t/q2-srs-qiime2-plugin-for-library-size-normalization-by-scaling-with-ranked-subsampling-srs/17661	用于通过使用排名子采样（SRS）进行缩放来规范库大小	[27]
   Q2-Phylogenize	https://forum.qiime2.org/t/q2-phylogenize-a-pipeline-for-associating-microbial-genes-with-environments-accounting-for-phylogeny/9971	使用系统发育回归将微生物基因与环境中的流行率或该环境相对于其他环境的特异性联系起来
   Q2-picrust2	https://forum.qiime2.org/t/q2-picrust2-updated-pipeline-for-metagenome-inference-with-denoised-sequences/6520	基于 16S 数据的 EC、KO 和 MetaCyc 通路预测	[21]
   Q2-ghost-tree	https://forum.qiime2.org/t/q2-ghost-tree-plugin-community-tutorial-for-creating-hybrid-gene-phylogenetic-trees/6139	将来自两个遗传标记数据库的序列数据组合成一个可用于多样性分析的混合系统发育树	[28]
   Q2-clawback	https://forum.qiime2.org/t/using-q2-clawback-to-assemble-taxonomic-weights/5859	组装分类权重	[29]
   Q2-perc-norm	https://forum.qiime2.org/t/q2-perc-norm-community-plugin/3922	对数据进行百分位归一化以允许跨不同数据集汇集数据的方法	[30]
   Q2-corncob	https://forum.qiime2.org/t/q2-corncob-community-tutorial/6138	corncob是一个使用丰度表和样本数据的单个分类单元回归模型	[31]
   Q2-gcn-norm	https://forum.qiime2.org/t/q2-gcn-norm-plugin-for-normalizing-sequences-by-16s-rrna-gene-copy-number/12715	基于rrnDB数据库的QIIME 2插件，用于通过16S rRNA基因拷贝数（GCN）对序列进行归一化	[32]
   Q2-qurro	https://forum.qiime2.org/t/visualizing-omic-feature-rankings-and-log-ratios-with-q2-qurro/14795	可视化“组学特征排名和对数比”	[33]
   Q2-hitac	https://forum.qiime2.org/t/q2-hitac-a-plugin-for-taxonomic-classification-of-fungal-its-sequences/25031	用于真菌ITS序列分类	[34]
   Q2-sourmash	https://forum.qiime2.org/t/q2-sourmash-a-plugin-for-generating-and-comparing-minhash-sketches/6276	用于生成和比较MinHash草图的插件	[35]
   Q2-repeat-rarefy	https://forum.qiime2.org/t/q2-repeat-rarefy-qiime2-plugin-for-generating-the-average-rarefied-table-for-library-size-normalization-using-repeated-rarefaction/18032	用于使用重复稀疏生成平均稀薄表，用于库大小规范化	[36]
   Q2-data-augment	https://forum.qiime2.org/t/q2-data-augment-qiime2-plugin-for-data-augmentation-using-rarefaction-rarefy-for-augment/18094	用于使用 rarefaction 进行数据增强	[36]
   Q2-FMT	https://q2-fmt.readthedocs.io/en/latest/tutorial/tutorial.html	用于评估粪菌移植（FMT）后微生物组的定植程度	[37]

常见问题

1. 外部导入特征表和代表序列
   其他常用扩增子分析流程如Mothur [38]、QIIME [9]、USEARCH [39]、VSEARCH [40]和DADA2 [12] 等分析流程的特征表和代表序列结果也可以导入QIIME 2继续分析。需要准备特征表（otutab.txt）和代表序列（otus.fa）两个文件，示例在本文github中或以下链接下载。特征表通用的BIOM格式可以直接导入QIIME 2 [10]，如果制表符分隔的纯文本格式需要使用biom命令转换为BIOM格式再导入[41]。
   
   wget -c http://210.75.224.110/github/MicrobiomeProtocol/e2.QIIME2/otutab.txt
   wget -c http://210.75.224.110/github/MicrobiomeProtocol/e2.QIIME2/otus.fa
   
   转换文本为Biom1.0，注意biom --version 2.1.5/8可以，2.1.7可能报错
   
   biom convert -i otutab.txt -o otutab.biom \
   --table-type="OTU table" --to-json
   
   导入特征表
   
   qiime tools import --input-path otutab.biom \
   --type'FeatureTable[Frequency]' --input-format BIOMV100Format \
   --output-path table.qza
   
   导入代表序列
   
   qiime tools import --input-path otus.fa \
   --type'FeatureData[Sequence]' \
   --output-path rep-seqs.qza
   
   
2. 导出特征表、代表序列和物种注释
   导出特征表为biom格式
   
   qiime tools export \
   --input-path table.qza \
   --output-path feature-table
   
   转换biom格式特征表为tsv格式
   
   biom convert -i feature-table/feature-table.biom \
   -o feature-table feature-table.txt \
   --to-tsv
   
   删除多余注释行
   
   sed -i '/# Const/d' feature-table/feature-table.txt
   
   导出代表序列
   
   qiime tools export \
   --input-path rep-seqs.qza \
   --output-path rep-seqs
   
   导出物种注释
   
   qiime tools export \
   --input-path taxonomy.qza \
   --output-path taxonomy
   

致谢

该研究由国家自然科学基金(32470055，U23A20148）、中国博士后科学基金(2024M753580）资助和农业科学与技术创新项目(CAAS-ZDRW202308）。

参考文献

1. GAO, G. F. and Chu, H. Y. (2020). Techniques and methods of microbiomics and their applications. Chinese Journal of Plant Ecology 44(4): 395–408. https://doi.org/10.17521/cjpe.2019.0222
2. 刘双江，施文元, 赵国屏（2017）.中国微生物组计划_机遇与挑战. 中国科学院院刊. https://doi.org/10.16418/j.issn.1000-3045.2017.03.004
3. Aggarwal, N., Kitano, S., Puah, G. R. Y., Kittelmann, S., Hwang, I. Y. and Chang, M. W. (2022). Microbiome and Human Health: Current Understanding, Engineering, and Enabling Technologies. Chem Rev. 123(1): 31–72. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.2c00431
4. Singh, B. K., Trivedi, P., Egidi, E., Macdonald, C. A. and Delgado-Baquerizo, M. (2020). Crop microbiome and sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 18(11): 601–602. https://doi.org/10.1038/s41579-020-00446-y
5. Xu, X. and Jiang, J. (2024). Engineering microbiomes for enhanced bioremediation. PLoS Biol. 22(12): e3002951. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002951
6. Gao, Y., Li, D. and Liu, Y. X. (2023). Microbiome research outlook: past, present, and future. Protein & Cell 14(10): 709–712. https://doi.org/10.1093/procel/pwad031
7. Liu, Y. X., Qin, Y., Chen, T., Lu, M., Qian, X., Guo, X. and Bai, Y. (2020). A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein Cell 12(5): 315–330. https://doi.org/10.1007/s13238-020-00724-8
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引用格式：杨海飞, 曾美尹, 高云云, 陈同, 刘永鑫. (2025). 使用QIIME 2 2025.4分析微生物组16S rDNA基因和ITS扩增子测序数据. // 微生物组实验手册. Bio-101: e1011032. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011032.
How to cite: Yang, H. F., Zeng, M. Y., Gao, Y. Y., Chen, T. and Liu, Y. X. (2025). Using QIIME 2 2025.4 to Analyze Microbiome 16S rDNA Gene and ITS Amplicon Sequencing Data. // Microbiome Protocols eBook. Bio-101: e1011032. DOI: 10.21769/BioProtoc.1011032.