摘要:将单菌、多菌或菌群移植到无菌小鼠体内,可通过小鼠模型直接研究细菌和表型的因果关系,是研究、筛选、评价细菌体内功能的重要方法。特别是将人的粪便经处理后移植到无菌小鼠,即粪菌移植 (Fecal microbiota transplantation, FMT),可通过小鼠模型直接研究肠道菌群和人类健康或疾病的因果关系,是人体微生物组和疾病微生物组研究的重要方法。这里,我们详细描述如何进行细菌样品采集、处理、移植、评价,从而实现无菌小鼠肠道细菌移植的整个过程和技术方法。
关键词: 无菌小鼠, 粪菌移植(FMT), 人源化菌群小鼠
研究背景
近年来微生物组的研究颠覆了人们对许多疾病的认知,已经证实肿瘤、消化、精神、代谢、心血管等多种疾病均与肠道菌群变化密切相关。无菌动物是指利用现有方法检测不到一切活的微生物和寄生虫的动物。从出生开始,无菌动物在其整个生命周期中均生活在与外界完全隔离的无菌环境中,其体内和体表不含有任何的微生物。其绝对无菌的微生物背景使其成为人体微生物组研究的理想模式动物和核心技术工具。无菌动物可以为疾病微生物组及靶标的预防、诊断、治疗和转化医学研究提供重要的支撑条件。将菌株或菌群移植到无菌动物体内可以研究、筛选、评价、鉴定微生物功能,是应用无菌动物研究微生物功能及作用机制的重要手段和实验方法。
实验原理
微生物样品经过处理后,通过灌胃的方法,将微生物由小鼠口腔直接注入到小鼠胃中,使其在小鼠肠道定植,从而实现无菌小鼠肠道微生物移植,研究微生物在无菌小鼠的功能和作用机制等。
材料与试剂
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15 ml离心管 (Thermo Scientific Nunc,catalog number: 339650)
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1.5 ml离心管 (Thermo Scientific Nunc,catalog number: 32195455321)
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2 ml冻存管 (CORNING, catalog number: 430488)
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哥伦比亚CNA血琼脂平板 (9 cm) (青岛海博生物,catalog number: HBPM0153)
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纱布
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封口膜 (PARAFILM,catalog number: P7793-1EA)
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1 ml无菌注射器 (上海康德莱企业发展集团股份有限公司,catalog number: 60017031)
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粪便采集器 (上海鼎杰生物科技有限公司,catalog number: DYC-524)
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磷酸盐缓冲盐 (碧云天生物技术公司,Beyotime,catalog number: C0221A)
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氯化钠溶液 (四川科伦药业股份有限公司,catalog number: B14200853444)
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无菌甘油 (Millipore Sigma, catalog number: G7893)
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液氮
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过氧乙酸 (山东瑞泰奇洗涤消毒技术有限公司,瑞泰奇过氧乙酸)
仪器设备
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8和10号小鼠灌胃针
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辐照灭菌托盘天平
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网滤筛 (绿若筛网制品厂,catalog number: 0565)
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-80 °C超低温冰箱 (赛默飞世尔科技 (苏州), Thermo Fisher Scientific, catalog number: 902GP-ULTS)
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涡旋仪 (Stuart Scientific, Stuart Scientific Shakers, catalog number: Z648531)
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离心机 (Microyn,Labnique, catalog number: MT-Spinplus-6)
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实验室匀浆机 (YL/友联仪器, catalog number: FSH-2A)
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洁净工作台 (苏净安泰空气技术有限公司,AIRTECH,catalog number: BCM-1000A)
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高温高压灭菌器 (山东新华医疗器械股份有限公司,实验动物专用型灭菌器,catalog number: BIST-A-D910-D-B)
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恒温水浴箱 (天津泰斯特仪器有限公司,catalog number: DK-98-II)
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紫外分光光度计 (Thermo Fisher,catalog number: GENESYS180)
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微生物培养箱 (Thermo Fisher,catalog number: IMH180)
实验步骤
一、样本采集和处理
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人粪便样本
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动物粪便样本
参照人粪便样本。但猪、猴、牛、马、大熊猫等动物粪便样本易含有未被消化的食物残渣等大颗粒,一般需要5) -7) 步骤。
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细菌样本
二、无菌小鼠灌胃
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按照物品无菌传递要求,将密封装有菌液样品的离心管传递进入隔离器内。
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提前将8号或10号小鼠灌胃针和1 ml注射器经高温高压灭菌后,按照物品无菌传递要求传入无菌隔离器内。
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用1 ml注射器吸取菌液,将灌胃针与注射器相匹配,详细操作见视频1。
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打开笼盖,用右手拇指和食指提起小鼠尾巴中部,并将小鼠放置在笼盖上。
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称量小鼠体重,根据小鼠体重进行灌胃,灌胃量约为10 μl/g。以每只无菌小鼠体重平均20 g为例,小鼠灌胃的体积约200 μl,菌量约2 × 107-2 × 108 cfu。每次使用仅打开一次,未用完丢弃。
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用左手拇指和食指第一、二指节抓住无菌小鼠耳后的颈部皮肤将其拎起,用无名指和小指夹其背部皮肤和尾部将其固定,同时应防止动物窒息。使其头、颈和身体呈直线。
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灌胃针头从动物嘴角进入,压住舌头,抵住上颚,轻轻向内推进,进入食管后会有刺空感。
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将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道,回抽注射器无空气逆流方可注入菌液。
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观察动物的反应,如无过度挣扎,可尝试推注,如阻力较小可推注所有药物,如阻力过大或动物反应剧烈,呼吸受阻,可缓解后再进行灌胃操作。
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松开动物,观察动物呼吸,如无呼吸异常,可确定灌胃成功。
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为提高微生物移植效果,可用等量菌液对小鼠下腹部和背部皮肤进行涂抹 (以皮肤被毛浸湿为准),小鼠可通过自身或相互舔舐摄取菌群;对于未断奶仔鼠的微生物移植,可在母鼠乳头部位涂抹菌液。
注:样本量根据具体实验方案和动物数量自行调整 (200 mg粪便/只/次)。常规菌群移植实验一周内灌胃2-3次 (致病菌除外) 可完成定植,仔鼠由于灌胃量较少,可灌胃3-5次完成定植。
视频1. 无菌小鼠灌胃操作
三、细菌定植检测 (可选)
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无菌小鼠灌胃成功一周后取粪便样本并留样进行16s rRNA测序或PCR检测。
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将1 ml EP管高压灭菌后传入隔离器内。
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粪便采集:双手进入隔离器后,固定小鼠,使其双手抓住笼盖,将其尾部提起,用手指轻轻按压小鼠下腹部,刺激小鼠排便,粪便样本放入对应编号的EP管中。
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将EP管接口处使用封口胶封口后按照无菌传递物品要求,将其传出隔离器。
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将装有样本的EP管立即至于-80 °C保存。建议保存时间在3-6个月。
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粪便样本和原始菌液同时进行16s rRNA测序或PCR检测,评估细菌定植情况。PCR分析,V3区或V6区多样性分析相似度达95%以上即定植成功。
溶液配方
无菌处理说明:
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灌胃针、1.5 ml离心管、15 ml离心管、纱布、滤筛等物品经132 °C,60 min高温高压灭菌达到无菌状态。
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物品传递时所需3%过氧乙酸配制液:
致谢
感谢魏泓教授团队全体成员的建议和帮助。已发表的使用过本实验方案的部分文章如下:
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:杨雨婷, 蒋先洪, 贺中明, 张天阳, 商海涛, 魏泓. (2021). 无菌小鼠肠道粪菌移植. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003646. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003646.
How to cite: Yang, Y. T., Jiang, X. H., He, Z. M., Zhang, T. Y., Shang, H. T. and Wei, H. (2021). Gut Microbes Transplantation of Germ-free Mice. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003646. DOI:
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