摘要:猪不仅是重要的家畜,也是一种经典的模式动物,因其与人类具有较为相似的解剖生理结构。对猪胃肠道微生物组成和功能的分析,有助于深入研究单胃动物消化道微生物在宿主营养代谢、肠道健康、免疫防御、疾病发生等过程中的作用。胃肠道微生物的种类和丰度根据其空间分布而存在较大差异,除内容物 (食糜) 外,胃肠道黏膜中也存在大量特殊的微生物群体,因而在实际采样过程中,食糜和黏膜是两种重要的样本类型。由于微生物广泛存在于各种环境,样品的采集流程和操作方式对肠道微生物相关的实验结果有直接影响,这一问题在环境条件极为复杂的养殖场更为突出。因此,标准化的样本采集流程和分析程序是保证实验的可靠性和重复性的必要条件。本文针对猪的胃肠道内容物和黏膜样本,介绍了其无菌采集和基因组DNA提取的详细方法,同时简要描述了微生物组成的分析方法。
关键词: 猪, 食糜, 黏膜, DNA提取, 微生物组成分析
材料与试剂
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各种型号 (10 μl, 200 μl, 1000 μl) 移液枪头
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离心管 (EP管,1.5 ml/2 ml)
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一次性无菌手套
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灭菌药勺
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75% 酒精棉球
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灭菌载玻片
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灭菌吸水滤纸
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PCR用8联管
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Tris-HCl
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95%和70%乙醇
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RNA酶 (天根生化科技有限公司)
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细菌、古菌、真菌通用PCR引物
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Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific公司)
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琼脂糖 (西班牙Biowest公司)
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GeneJET 胶回收试剂盒 (Thermo Scientific公司)
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Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒 (Thermofisher 公司)
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苯酚-氯仿-异戊醇溶液 (体积比:25:24:1)
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CATB buffer (溶液配方)
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TE buffer (见溶液配方)
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3 M醋酸钠 (NaAc) 溶液 (见溶液配方)
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TAE缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
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涡旋仪
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离心机 (Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R 微量离心机)
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PCR仪 (Bio-rad T 100梯度 PCR仪)
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恒温水浴锅
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移液枪
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MP研磨仪 (美国MP Biomedicals FastPrep-24 5G)
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NanoDrop 2000超微量分光光度计 (Thermo Scientific)
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Bio-rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统
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Dark reader荧光投射切胶仪
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制胶槽
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Thermofisher IonS5TMXL 测序平台
实验步骤
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猪胃肠道内容物采集
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猪胃肠道黏膜采集
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食糜和黏膜基因组DNA的提取
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扩增子文库构建和序列分析
注意事项
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在采集胃肠道内容物和黏膜的过程中,分离各段消化道时,锡箔纸下方须垫冰袋,以保证采样过程的低温。
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采集各肠段内容物或黏膜时,每头猪须尽量在同一位点进行取样,以最大程度降低取样部位不同带来的误差,可用标尺对取样位点进行准确定位。
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刮取肠道黏膜时力道尽量轻柔、均匀,不能刮破胃肠壁;一般对每头猪而言,肠黏膜样品装至一支2 ml冻存管的3/4满即可,视具体情况酌量增、减。
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无论采集内容物或黏膜样本,一次性手套、采集勺或载玻片均应“一猪一换”和“一部位一换”,切不可混用造成样品污染。
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采样过程注意无菌操作,采样人员需严格佩戴口罩;采样房间应提前用紫外灯照射1 h;操作台应事先采用75%酒精喷洒消毒。
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在DNA提取过程中,如果样品研磨后非常黏稠,可吸取部分糊状物到新的锆珠管中,再加入700 μl CTAB buffer,混匀后70 °C孵育,再重复之前的步骤。
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用于PCR扩增的所有试剂均应事先置于冰上融化,用完后及时放回-20 °C冰箱保存。
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进行PCR扩增时为了保证数据的可靠性,需要设置阴性对照 (不加DNA模板,以同体积的灭菌双蒸水替代) 和阳性对照 (如单一菌株的DNA)。
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在进行PCR扩增前,模板必须进行纯化,以及引物序列必须进行优化,以保证PCR反应的专一性。
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实验过程中所使用的各类耗材必须经过灭菌处理。
溶液配方
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CTAB buffer
CTAB (北京博奥拓达科技有限公司) 4 g, NaCl 16.364 g, 1 M的Tris-HCl 20 ml (pH 8.0),0.5 M的EDTA溶液8 ml,先用70 ml去离子水溶解,再定容至200 ml, 121 °C,20 min高压灭菌后,待用。
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TE buffer
首先用900 ml的去离子水溶解1.576 g 的Tris-HCl;加2 ml 0.5 M的EDTA (pH 8.0);调整pH至7.6;用去离子水定容至1.0 L, 121 °C,20 min高压灭菌后, 待用。
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TAE buffer
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3 M的醋酸钠溶液
将408.1 g的NaAc·3H2O溶于800 ml去离子水中。用冰醋酸将pH调至5.2 后。加入去离子水定容至总体积为1.0 L。121 °C, 20min高压灭菌后,待用。
致谢
本工作受国家自然科学基金 (31872369、32072743) 和四川农业大学双支计划项目资助,特致感谢!目前已应用本实验方案发表文章30余篇,部分如下:
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罗玉衡, 陈洪, 余冰, 何军, 黄志清, 毛湘冰, 郑萍, 虞洁, 罗钧秋, 陈代文. (2017). 短期或长期饲喂高水平豌豆纤维对猪盲肠微生物群落结构和代谢产物的影响. 畜牧兽医学报 48(8):1459-1467.
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张玲, 罗玉衡, 陈代文, 余冰, 何军, 虞洁, 罗钧秋, 毛湘冰, 黄志清, 郑萍, 罗玉衡. (2017). 饲粮中短期内单独及混合添加高水平燕麦β-葡聚糖和微晶纤维素对小鼠生长性能、器官指数和粪便细菌群落结构的影响. 动物营养学报29(007): 2407-2415.
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Li, J. Y., Chen, D. W., Luo, Y. H., He, J., Huang, Z. Q., Mao, X. B., Zheng, P., Yu, J., Luo, J. Q., Tian, G. and Luo, Y. H. (2020). The fungal community and its interaction with the concentration of short‐chain fatty acids in the faeces of Chenghua, Yorkshire and Tibetan pigs. Microb Biotechnol 13(2): 509-521.
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Li, J. Y., Luo, Y. H., Chen, D. W., Yu, B., He, J., Huang, Z. Q., Mao, X. B., Zheng, P., Yu, J., Luo, J. Q., Tian, G., Yan, H., Wang, Q. Y. and Wang, H. F. (2020). The fungal community and its interaction with the concentration of short‐chain fatty acids in the caecum and colon of weaned piglets. J Anim Physiol Anim Nutr 104(2): 616-628.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李佳彦, 李华, 罗玉衡. (2021). 猪胃肠道内容物和黏膜样品采集与微生物组成分析. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003670. DOI:
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How to cite: Li, J. Y., Li, H. and Luo, Y. H. (2021). The Collection of Gastrointestinal Content and Mucosa from Pigs for the Analysis of Microbial Community. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003670. DOI:
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