在插入位点(5013391)处,取前后1Kb的序列如下 (加粗为引物潜在区):
1 agcccaaccc gaccctgccc cgcctcgttg ccatccctag ctgcaacctc gggtgcccca
61 ccagcgagca tgggcaattc cgtctcatca cccggtattc caacgaaaaa gatttcaaaa
121 atgcacaaaa cgatcgaaat ggcaaagtga ctgtgagtac gcgcttcata ttgacatttt
181 aacgaagcgt gtttttgaga tggcattcca atgatactgt tttttaaacc tggtcaaatg
241 tccattttct agttcgggac ttcccagtcc tagccatgta gcctgagagc tgagatacac
301 accccagcag tatcctgtgc aaggcatgat cgagtcgaat ccgtccctgc caatggcaca 361 agtcttttca agggggtgtt tagcccctct cccccccccc ccccccctag ctagctggta 421 gtggctggcg ctacgcatgc acaggcacgt cgcttcgccc gctgcgtgca tcatatgcat 481 ccatccatct ggtctcctgt tttatggacg gacgggtcgc tgcacgggcg gtctgcacgc 541 tgtcacgcgc agcctggcat acgggcttgt catatgtcaa agatgcagac acacacgaca 601 caagagccag ttggggttgg gaggttgcgc gtagcctctt tcccacacgt gaccccctcc 661 ctactctccc cactgccgcc acaacttacc aggatccatg cgagaatcgc accaaaaacg
721 ccaccaatct cgtgaactcc accacctcca tcgtatcgcc cggcctttcc actagctagc
781 agcctagcac acagctgatc gatcggcgaa gctagtcacg ccacggcgat gcgattatcc
841 cggtgtcgtt tacgcggcgg ccgctagggt gtcggatggg ctatgtcgtc gtcgttgcca
901 ctgcttgtgt gtgtaccaaa tcgggtgcgt tgtttcgact gttggtcgat gcgagtacct
961 accgcatgtg atggacgggc ctgcaggcga cttgtcgatg gcaacgtact cacccggcct
1021 agcatacgac ctgctgcctg tctcgtgaac gccacgaagc ggcagcctgc atgtcgttta
1081 cgaggagccc ttagattccc ctccagaatt aggagtacac gccctgtgtt ggtgtcgatc
1141 aatcgataat gtagattgat cgcaatcgag atgggtgttg atgagcagga tcatatccat
1201 cctcctcttg ggggtttctc tgcaggctcc tgacagacaa tgaatgtgtg cacatgatca
1261 atgcagatgc gtgcagctat cgaaatcttg gttggtactt gtcctggatg gcttgattag
1321 attgttaata ccaaaacaca ttttttcgct catactgata tacgagtagt agtaggactt 1381 cctcgtgagc tctcttgaat tcatgtgtgt cggagcggca gcgtcacacg ctgcgcccct 1441 acgcattttt aggatctcag agcagtcatc agtcttcgtg tacctcagta ctttgaattc 1501 tctttgcctg tagcagatgc tttttttttt tgacatgaat agcagatgca ttcactgtgc 1561 attcccttcc cccttctctc gatcgacgcg acttacccgt atactgcatc actgcaaact 1621 cacataaatt tacccgtgac cgtgtgcccg tgtgatcatc ctccaatcaa actgtccttc 1681 ccttttcacc ttaaaaggac cggccggaac gcttctctca tcttccagtc gtactattac 1741 agtccagtcg ccgcaatgga tggctggcat gtcaaagatg atgaattggt gatggtggca
1801 cccggttgca cttgcgcccg cggctggcaa cgcggcatca cagatctcac acgcgcggac
1861 taaaaaccga cgtgacaaca cggccgcggc caacgacgag accggccggt atgggagctt
1921 gccgctgcat gcgacgtcga cgttgatgtg gccaagacac ggagcgttac gtatagtgcg
1981 ctcgtacgca ggcgcgcatg c
针对这段序列设计两条引物 (下图中AS,S,图7),产物大小在800至1200bp之间 (建议在1Kb左右),插入位点在产物中间位置 (距离产物两端400-600bp均可)。
图7. 03Z11AA66 T-DAN在基因组上插入位置方向示意图 对于03Z11AA66家系而言,则应该选择引物组合为:S+AS/AS+NTLB5或者S+AS/S+PFRB4,由于我们分离出的是左端序列,您一般用NTLB5来验证杂合、纯合,即选用组合S+AS/AS+NTLB5。当然也可以选择S+AS/S+PFRB4组合,特别是第一个组合扩增不出来的时候。