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DNA甲基化检测
Detection of DNA Methylation by Bisulfite-sequencing, Restriction Enzyme Digestion-PCR and Restriction Enzyme Digestion-Sourthern   

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方法一: 重亚硫酸盐测序 (Bisulfite-sequencing)

实验原理:以重亚硫酸盐处理基因组DNA,发生甲基化的胞嘧啶不变,而未甲基化的胞嘧啶会变成尿嘧啶,经过PCR扩增,原本的C/G就变成T/A,可以通过测序区分。该方法检测精确,分辨率最高,但耗时耗力,通量有限。
实验目的:一般以下情况可以用此方法:精细定量检测目标区段的DNA甲基化情况;结合高通量测序检测全基因组DNA甲基化情况。

关键词: DNA甲基化, 高通量测序, 重亚硫酸盐

材料与试剂

  1. PCR管
  2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
  3. 高质量基因组抽提试剂盒,常用的如DNeasy plant mini kit
  4. 重亚硫酸盐处理试剂盒,常用的如EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, catalog number: 59104)

仪器设备

  1. PCR仪
  2. 移液器
  3. 离心机
  4. 水浴锅

实验步骤

  1. 高质量DNA样品抽提:目前基本都是使用商业化的试剂盒,常用的如DNeasy plant mini kit,处理方法参照试剂盒说明书。
  2. DNA样品处理:目前基本都是使用商业化的试剂盒,常用的如EpiTect Bisulfite Kit,处理方法参照试剂盒说明书。
  3. 引物设计:针对检测的目标区域设计PCR引物,一般有专门的软件可供使用,如 MethPrimer等,可参考文献Li and Dahiya (2002), Tusnady等(2005)。
  4. PCR扩增和产物克隆:以重亚硫酸盐处理后的DNA为模板扩增,回收PCR产物后克隆的T载体上,挑取30个以上的阳性克隆进行测序,保证至少30个有效克隆(即重亚硫酸盐成功转化的DNA片段连进载体得到的克隆)。
  5. 结果分析:结果分析网站http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl,分别建立两个文本文档,一个为目标区段的基因组序列,一个为测序的结果,将序列以FASTA格式保存,如图1为目标区段的参考序列形式,图2为测得的序列形式 (测序结果直接复制到该文件中,不需要任何处理,分析软件会自动去掉不匹配的序列),分别将这两个文档上载到“Reference sequence file”和“Comparison sequences file”选项中;结果运行完成后,根据需要选择不同的表现形式(视频1)。

    视频1. 结果输出操作示例

    1)
    准备工作:核酸比对工具(这里示意为Bioedit)、所测DNA片段的基因组序列 (不包括引物序列)、BS-clone后sanger测序得到的序列。
    1. 将基因组序列和BS-clone后测序所得到的序列导入到Bioedit中(图1)。


      图1. Bioedit显示参考基因组序列以及测序序列

    2. 通过将BS-clone得到的序列与基因组序列进行比对(图2),然后将我们所需要的目标区域的BS-clone得到的序列复制出来粘贴到另一个新建的文本文件中(图3)。


      图2. 参考基因组序列以及测序序列对比

    2)
    在线计算DNA胞嘧啶甲基化水平
    1. 输入文件与方法一不同的地方使我们需要将基因组序列和BS-clone得到的序列分为两个文件,且此方法不需要预先处理序列,直接拿测回得到的序列进行分析即可。
    2. 打开网站kismeth http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl,然后按照如下图(图3)步骤进行。


      图3. 导入参考基因组序列以及测序序列

    3. 显示页面就包含了CG、CHG、CHH甲基化比例的具体信息(图4),以及每个位点的甲基化比例的柱状图(图5),让人看起来一目了然。当然也包括像方法一展示的那样的dotplot图(图6)。可以看出方法二比方法一是要简便很多,但是如果要追求dotplot图的美观,选方法一更优。


      图4. CG、CHG和CHH序列整体甲基化比例

      图5. 每个位点的甲基化比例(柱状图)

      图6. 每个位点的甲基化比例(斑点图)

注意事项

  1. DNA样品处理要完全,否则未处理完全的胞嘧啶会被错当作甲基化的,可以通过检测一些已知是否发生DNA甲基化的序列来判定是否处理完全,可参考文献Wang等(2011). 但是处理的太过会造成DNA的过度断裂,影响PCR扩增。
  2. 处理会造成的序列的改变和DNA的断裂,设计引物时无法知晓匹配的位置是C还是U,因此可以在有胞嘧啶的位置以简并引物代替;若软件无法得到合适的引物,可参考文献Henderson等(2010)手动设计。
  3. 若PCR扩增遇到困难,可采用Touch-down、Nested-PCR等方法,根据个人经验效果比较好的是Nested-PCR,即在目标区域外围设计一对引物,降低退火温度,牺牲特异性以换取扩增产物,再用目标引物进行正常扩增。如果利用Nested-PCR,在用外围引物进行扩增时,可能得到弥散的DNA带,这个属于正常现象;将此步的PCR产物,作为下一步PCR的模板进行扩增。注明在第一轮PCR的时候,尽可能选择较低的退火温度;在第二轮PCR扩增的时候,如果有条件可以,可以梯度设置PCR仪器的退火温度,寻找目标带清晰,且杂带较少的PCR扩增条件。
  4. 一般地,如果所研究的物种有参考基因组以及DNA胞嘧啶甲基化图谱,可以下载图谱的可视化文件,在IGV等软件中搜寻目标区域,查看其DNA甲基化水平,并结合该区域附近的转座子以及sRNA富集情况综合考虑引物设计位置。


方法二: 酶切-PCR

实验原理:不同的限制性内切酶对其识别序列中C的甲基化的敏感程度不同,如以对甲基化敏感的限制性内切酶消化基因组DNA,若其识别序列发生了DNA甲基化则无法完成切割,再以此DNA为模板进行PCR扩增就可以得到目标条带,反之则无法扩增,从而判断该区段的相对DNA甲基化情况。相比较重硫酸盐测序,该方法操作简单,但分辨率不够。
实验目的:一般以下情况使用该方法:定性检测目标区段的DNA甲基化。
关键词DNA甲基化内切酶消化PCR

材料与试剂

  1. PCR管
  2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
  3. 限制性内切酶,常用的如:HaeIII (NEB,R0108)、HpaII (NEB,R0171)、MspI (NEB,R0106)、McrBC (NEB,M0272)等
  4. 琼脂糖
  5. PCR引物

仪器设备

  1. 移液器
  2. PCR仪
  3. 电泳装置

实验步骤

  1. 高质量基因组DNA抽提。
  2. 取500 ng DNA,加入20 U的McrBC完全酶切。
    注:酶的具体用量和酶切时间请参考特定的内切酶的说明书,但是要保证完全酶切。
  3. 以特异的引物进行PCR扩增。
  4. 琼脂糖凝胶电泳。OsDRM2是一类负责维持CHH序列甲基化的DNA甲基转移酶,osdrm2的缺失导水稻全基因组CHH序列的大量丢失;如图7所示,利用野生型(WT)和osdrm2突变体材料,利用HaeIII消化酶切,选取某个位点设计引物进行PCR扩增。由于control中并没有加入HaeIII,所以WT和osdrm2突变体的PCR产物亮度一致,也说明酶切体系中DNA的量一致。在HaeIII加入的体系中,osdrm2突变体亮度消失。由于HaeIII是一种DNA甲基化敏感酶类,无法消化高甲基化区域,但是可以消化GGCC序列,因此在osdrm2突变体中该区域相比于野生型CHH甲基化修饰,从而可以被HaeIII消化。


    图7. 水稻野生型及突变体HaeIII及McrBC酶切PCR示意图(来自Tan等,2016 [Plant Physiology, 171:2041-2054)。OsDRM2是一种负责维持CHH序列甲基化的DNA甲基化转移酶,osdrm2是其功能缺失型突变体,WT为其野生型;control为不加HaeIII的反应体系。

注意事项

  1. 结果分析时,不同的酶性质不一样,如McrBC特异切割甲基化的识别序列,而HpaII则对甲基化敏感。
  2. 植物中的DNA甲基化分为CG、CHG和CHH (H=A, T, C),一般分别用HpaII、MspI和 HaeIII加以区分。


方法三: 酶切-Southern blot

实验原理:与酶切-PCR类似,将内切酶消化后的基因组DNA进行Southern blot分析,检测DNA甲基化情况。
实验目的:一般以下情况使用该方法:定性检测目标序列的DNA甲基化;为了研究目的基因是否影响DNA甲基化,可以此方法检测5S rDNA、着丝粒等具代表性的DNA序列的甲基化。
关键词:DNA甲基化,内切酶消化,Southern blot,5S rDNA,着丝粒

材料与试剂

  1. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
  2. 限制性内切酶,常用的如:HaeIII (NEB,R0108)、HpaII (NEB,R0171)、MspI (NEB,R0106)、McrBC (NEB, M0272) 等

仪器设备

  1. 移液器
  2. PCR仪
  3. 电泳装置

实验步骤

  1. 取5-10 μg基因组DNA,分别加入 10 U的HpaII、MspI和 HaeIII,37度酶切3小时左右,反应进行到2小时时即可取样进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的消化情况,酶切判断标准同一般的Southern blot。
  2. 后续步骤同Southern blot (见实验方案Southern Blot [吴昊等,2018])。
  3. 结果分析:以5S rDNA为例,见图8,HpaII和MspI识别同样的序列CCGG,HpaII对2号位C的甲基化敏感而MspI对2号位的不敏感,对1号位的C敏感,因此分别用于识别CG和CHG甲基化。由图8可知,HpaII没有消化DNA而MspI消化了,说明CG甲基化程度高而CHG甲基化程度相对较低;再比较MspI处理的三个材料,从左至右DNA被消化的程度越来越高,说明CHG甲基化程度逐次降低。


    图8. 野生型以及kypcmt突变体酶切southern-blot示意图(来自Jackson等, 2002 [Nature, 416:556-560])

参考文献

  1. 吴昊等.(2018). Southern Blot. Bio-101 e1010104. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010104. (in press)
  2. Chen, X., Liu, X., Zhao, Y. and Zhou, D. X. (2015). Histone H3K4me3 and H3K27me3 regulatory genes control stable transmission of an epimutation in rice. Sci Rep 5: 13251.
  3. Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L. and Jacobsen, S. E. (2010). Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics 5(1): 47-49.
  4. Jackson, J. P., Lindroth, A. M., Cao, X. and Jacobsen, S. E. (2002). Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416(6880): 556-560.
  5. Li, L. C. and Dahiya, R. (2002). MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 18(11): 1427-1431.
  6. Southern, E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98(3): 503-517.
  7. Tan, F., Zhou, C., Zhou, Q., Zhou, S., Yang, W., Zhao, Y., Li, G. and Zhou, D. X. (2016). Analysis of Chromatin Regulators Reveals Specific Features of Rice DNA Methylation Pathways. Plant Physiol 171(3): 2041-2054.
  8. Tusnady, G. E., Simon, I., Varadi, A. and Aranyi, T. (2005). BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res 33(1): e9.
  9. Wang, J., Wang, C., Long, Y., Hopkins, C., Kurup, S., Liu, K., King, G. J. and Meng, J. (2011). Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods 7: 39.
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Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈香嵩, 程赛凤, 周超, 刘潜, 赵毓. (2018). DNA甲基化检测. Bio-101: e1010110. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010110.
How to cite: Chen, X. S., Cheng, S. F., Zhou, C., Liu, Q. and Zhao, Y.  (2018). Detection of DNA Methylation by Bisulfite-sequencing, Restriction Enzyme Digestion-PCR and Restriction Enzyme Digestion-Sourthern. Bio-101: e1010110. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010110.
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