丛枝菌根真菌菌种资源收集、培养与保藏方法
Method of Collection, Cultivation and Storage of AM Fungi Strain Resources   

材料与试剂

1.  一次性无菌PE手套
2. 消毒湿纸巾 (75%医用酒精湿巾)
3. 塑料自封袋 (9号自封袋，宽20 cm × 高28 cm)
4. 标签纸
5. 铅笔 (HB)
6. 记号笔
7. 布袋 (宽22 cm × 高35 cm)
8. 干净的纸 (新复印纸)
9. 吸水纸 (Vinda/维达V4609有芯卷纸)
10. 采样记录本
11. 塑料托盘
12. 玻璃棒
13. 玻璃培养皿和塑料培养皿 (直径9 cm) 
14. 表面皿
15. 高粱 (Sorghum bicolor (L.) Moench)种子
16. 沸石2 mm (河北省全利饲用沸石粉有限公司) 
17. 河砂 (小于2 mm的水洗砂) 
18. 蒸馏水
19. 无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，分析纯AR，catalog number: 10009218)
20. 次氯酸钠溶液 (国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，catalog number: 80010428，活性氯 ³ 5.2%)
21. 甲醛溶液 (上海久亿化学试剂有限公司，分析纯AR，甲醛含量37-40%)
22. Hoagland's (霍格兰) 营养液 (参考《现代实用无土栽培技术》141-146页)
    

仪器设备

1. 小铁锹
2. 剪刀和枝剪
3. 花盆 (高210 mm ´ 口径170 mm) 
4. 50穴加深苗盘 (54 cm × 28 cm × 10 cm) 
5. 单道移液器 (20-200 µl; Eppendorf, catalog numbers: 3120000054)
6. 移液器枪头 (200 µl; Axygen, T-200-Y)
7. 壁纸刀
8. 镊子 (蒂梵妮尔；NZ-037；长12.3、17.9、24.5 cm)
9. 洗瓶
10. 筛子 (孔径分别为0.8、0.25、0.055 mm) 
11. GPS (Garmin/佳明 GPSMAP)
12. 相机 (佳能EOS 6D或像素较高的手机相机)
13. 4 °C冰箱 (青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-290W)
14. 压力蒸汽灭菌锅 (致微(厦门)仪器有限公司，型号：GR60DA)
15. 电子天平 (奥豪斯仪器(常州)有限公司，型号：Valor)
16. 光照培养室 (北京库蓝科技有限公司建设，飞利浦农艺钠灯400 W，光照强度10,000-15,000 lx，光照时间16 h) 
17. 体视镜 (Nikon SMZ1500，照相系统) 
18. 生物显微镜 (Nikon ECLIPSE80i，配DIC和照相系统) 
19. 酒精灯
20. 净水器 (安利益之源100188CH净水器)
    

实验步骤

一、野外调查及样品采集

1. 准备需要的采样工具 (一次性无菌PE手套、小铁锹、消毒湿纸巾、剪刀和枝剪、塑料自封袋、标签纸、铅笔、记号笔、布袋、照相机、采样记录本、GPS等)，根据采样目的选择调查地点、样点和长势良好的寄主植物，记录调查地点的行政区划名称、地理坐标、地形、植被、土壤类型、土壤质地、寄主植物名称及生长状况等，并对生境拍照（视频1）。
2. 去除地表枯枝落叶、大块砂石和其他杂物，用小铁锹 (消毒湿纸巾擦拭干净) 沿寄主植物周围垂直向下挖取根系和根区土壤。对于矮小草本植物，尽量将整株植物及其根系挖出（通常挖取长20 cm × 宽20 cm × 高 20 cm的根区土壤）；对于灌木或高大木本植物，首先需要寻找该植物新生根系分布的区域，根据新生根系分布状况确定采挖位置和深度，通常在直径小于1-2 mm的细根分布密集区域挖取根系和根区土壤（视频1）。
3. 剪掉植株地上部分，连根带土大约2 kg放入两层塑料自封袋中 (可根据需要调整样品量)，如需长途运输，第二层为布袋，在两层袋之间放入写有采样编号的标签，封口后带回实验室备用（视频1）。
4. 样品带回实验室后，在干净的纸 (新复印纸) 上将野外采集样品中的根剪碎成约1 cm的小段与袋内土壤混匀后，分成两部分：一部分风干保存用于土壤理化性质的测定、孢子密度计数等；另一部分立即进行诱导培养，或4 °C冰箱保存尽快进行诱导培养。
   
   
   
   视频1.野外调查及样品采集
   

1. 按质量控制要求准备高粱种子（参见“质量控制”部分）、灭菌的沸砂基质、塑料花盆 (高210 mm ´ 口径170 mm) 和洁净的水，备用 (图1A)。
2. 在干净复印纸上或塑料封口袋中，将准备好进行诱导培养的土样与灭菌的沸砂基质按体积比1:1混匀，装入消毒的塑料花盆3/4处，用洁净的水浇透，播种催芽的高梁种子30-50粒 (图1B)。种子上面加盖0.5-1 cm灭菌的沸砂基质，浇少量洁净的水，注意避免将种子冲到基质表面。
3. 放置光照培养室生长至少3个月 (图1C)，培养条件参见“质量控制”部分。在植物缺水时适量浇洁净的水，在植物显示缺肥时补浇适量20%的霍格兰营养液。
   
   
   图1. 诱导培养的材料准备 (A)、播种 (B) 及光照培养 (C) 

1. 接种前3-4 d用湿筛法从诱导培养的土壤中提取孢子。将形态各异的孢子放到装有灭菌蒸馏水的不同表面皿中区分摆放，放入4 °C冰箱保存，每天清洗（持续3-4 d）并去除失活和破损孢子，保留洁净、新鲜、光亮、饱满的孢子备用（视频2）。
2. 按质量控制要求准备高粱种子（参见“质量控制”部分）、灭菌的沸砂基质、50穴苗盘、塑料花盆和洁净的水，备用。
3. 50穴苗盘装入灭菌的沸砂基质至每穴2/3处，用洁净的水浇透。使用装有200 µl枪头的移液器（量程20-200 µl）在体视镜下吸取孢子，直接滴放在装好并浇水的基质上，每穴放1个孢子，再加盖1-2 cm灭菌沸砂基质于孢子上，补适量洁净的水，播种催芽的高梁种子2-3粒，覆盖0.5-1 cm灭菌的沸砂基质（视频2）。
4. 放置光照培养室培养（培养条件参见“质量控制”部分）。6-7周后将单孢培养苗盘中的高梁苗与培养物一起取出，放在已消毒的塑料盘中，用火焰灭菌的壁纸刀将培养物纵向切取整体的1/4（视频2），进行湿筛。在体视显微镜下检查菌丝量及孢子繁殖情况，无侵染或无孢子的丢弃（视频2）。
5. 有孢子或有较多菌丝的样品继续培养。将消毒的塑料花盆中装入灭菌的沸砂基质至1/3处，上述检查后确定已有孢子的剩余3/4培养物与高梁苗，直立于塑料花盆 (高210 mm ´ 口径170 mm塑料盆) 的中心位置，周围添加灭菌的沸砂基质到花盆3/4处，用洁净的水浇透，播种催芽的高梁种子30-50粒/盆，覆盖0.5-1 cm灭菌基质（视频2），浇少量洁净的水。
6. 放置光照培养室培养至少3个月，培养条件参见“质量控制”部分。在植物缺水时适量浇洁净的水，在植物显示缺肥时补浇适量20%的霍格兰营养液。
   
   
   
   视频2. 单孢培养操作过程
   
   

1. 在称样区内，称取待扩繁菌种样品50-100 g备用，或在体视镜下挑取待扩繁菌种的孢子50-200个备用。
2. 按质量控制要求准备高粱种子（参见“质量控制”部分）、灭菌的沸砂基质、塑料花盆 (高210 mm ´口径170 mm) 和洁净的水，备用 (图2A)。
3. 塑料花盆中装入灭菌的沸砂基质至2/3处 (图2B)，将上述备用接种剂均匀平铺在基质上 (图2C)，或将上述备用孢子均匀滴放在基质上。再加盖灭菌沸砂基质2 cm厚，用洁净的水浇透，每盆播高梁种子30-50粒 (图2D)，覆盖0.5-1 cm灭菌沸砂基质，浇少量洁净的水。
4. 放置光照培养室培养至少3个月 (图2E)。在植物缺水时适量浇洁净的水，在植物显示缺肥时补浇适量20%的霍格兰营养液。
   
   
   图2. 菌剂扩繁培养过程

1. 上述盆栽 (包括：诱导培养、单孢培养、扩繁培养) 在光照培养室培养至少3个月以后，准备收获。先将花盆置于温度湿度相对稳定的房间内干燥 (根据所在地区相应调整，北方城市和南方城市的冬天可以直接在无光照的室内自然晾干，南方城市在空气湿度较高的季节建议用空调及除湿机等调整空气温湿度，保证约1-2周时间内培养物干燥)，然后收获所有盆中培养物 (包括植物根系、菌丝、孢子和基质)。
2. 操作人员双手洗净并用吸水纸擦干后，带一次性PE手套将桌面用75%酒精消毒后 (图3A) 覆盖三层干净的纸 (新复印纸)，将盆中培养物倒在纸上，捣碎，去除较大的粗根 (图3B)。取50-100 g培养物，检查孢子种类、纯度、数量及鉴定种类。
3. 用两张纸卷起剩余培养物，纸筒的一端插入预先准备的塑料自封袋中 (图3C)。当所有的培养物都转移入袋中后，轻轻取出纸，封上袋，任何时候都不要让手接触到盆栽培养物 (或戴一次性手套)，再在外面套一个相同的自封袋，两个自封袋之间放入标签 (图3D)。
   
   
   图3. 收获及菌种保藏过程

六、菌种保藏
装袋准备保藏的培养物按属种顺序放置于冷藏室或4 °C冰箱中保存 (图3E)。AM真菌通常保藏盆栽的“全培养物”，即剪去植株地上部分后培养容器中的所有基质、根系、孢子和菌丝。由于根系在长期保存过程中，容易霉变，滋生其他微生物，可以选择去除不保藏。最好使用4 °C种子柜保存培养物，如果条件不具备也可使用风冷冰箱或冷藏室 (空调控温16-18 °C) 保存。

七、质量控制
由于AM真菌菌种资源收集与保藏的各个步骤 (包括：诱导培养、单孢培养、扩繁培养、取样、检查、收获等) 都是在开放或半开放的有菌环境下进行，并且培养时间较长 (一般3个月以上)，因此，必须尽量保持操作和培养空间洁净，寄主植物健康，尽可能降低植物病原物、腐生生物和昆虫等的滋生、有毒或有害物质的污染等。

1. 寄主的选择与种子消毒：一般选用对AM真菌依赖性较大、对菌种专一性较小、根系较发达，适合温室盆栽的植物。已经成功运用的物种有高粱、三叶草、苜蓿、紫云英、烟草、玉米、洋葱、苏丹草和小麦等。本方法选择使用高粱作为寄主植物。高粱种子用1%甲醛溶液浸泡5 min消毒后，用蒸馏水清洗数次，再于蒸馏水中浸泡2-3 h后装入上下盖中均装有湿润滤纸的培养皿中，25-30 °C催芽24 h，中间用蒸馏水清洗种子1次。
2. 基质的选择与灭菌：文献报道用过的生长基质包括树皮、泥炭、陶粒、沸石、河砂、蛭石、珍珠岩、钙质黏土和膨胀黏土等，可以用一种或几种不同比例的组合。本方法选择使用沸石和河砂1:1混合作为生长基质。沸石和河砂按体积1:1混合，加水拌匀成潮湿状，装布袋。95-100 °C常压蒸汽灭菌2 h，间隔24 h，相同条件下灭菌1 h，放置1-2周后使用。
3. 培养容器的选择与消毒：培养容器的大小应当与根系生长时的实际空间相匹配，采用塑料或容易清洁的材质，所有容器使用前均需消毒。可以用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡30 min，淋干，备用。也可以用70%-75%的乙醇溶液擦拭，淋干，备用。
4. 接种过程、取样检查、收获等操作的质量控制：接种、取样、收获等步骤不在超净工作台中进行，要求在洁净的室内空间完成，尽量减少空气流动，以最大限度减少操作过程中培养物微粒在空气中散布所造成的交叉污染。每次工作前后操作桌面要用70%-75%酒精擦拭消毒。在处理干培养物时，空气中会迷漫大量培养物微粒并沉积下来，可向空中喷水或喷0.5%的次氯酸钠溶液，清除空气中的微粒。
5. 光照培养室和温室的质量控制：为了高效培养AM真菌菌种，确保无病原物、无虫卵和最低数量的其他腐生生物，需要建立专门用于AM真菌培养的光照培养室或温室，并设专人管理，严格禁止在培养室内进行土壤和植物的处理操作。光照培养室或温室的地板及培养架在每一个培养周期完成后彻底清洗消毒。培养过程中严格观察、控制病虫害的发生，一旦观察到有土传病害存在的症状 (如生长下降、失绿、叶片变薄等) 应立即检查基质和根系，如检测到病原菌，应立即丢弃，重新开始盆栽。
6. 生长管理的质量控制：AM真菌的分离及定期复壮均采用盆栽的方法进行，期间应注意浇水、营养液使用、光照、温湿度及病虫害控制等。本培养方法光照培养室参数控制：光照强度10,000-15,000 lx，光照时间16 h温度21-28 °C，新风机通风量50%。人工适量浇洁净的水，做到基质的干湿交替，尽量避免过湿或过干。为保障用水清洁，采用安利净水器。一般认为，过多的肥料，特别是P和N的含量过高，会抑制AM真菌的生长与产孢，只有当植物出现缺素症状时补浇适量20%的霍格兰营养液。杀虫剂能够影响AM真菌的侵染和产孢数量，但是为了防止昆虫引起盆栽中的交叉污染，或对植株生长产生影响，可以应用一些昆虫杀虫剂。

注意事项

1. 野外采样一般选择寄主植物基本停止营养生长，开花结果期为采样时间，此时大部分AM真菌的孢子已经成熟，易于进行菌种鉴定、分离和培养。
2. 一些AM真菌的较大孢子果会分布在表层土壤中，采样时避免去掉表层土壤，只需挑出枯枝落叶、大块砂石和其他杂物即可。
3. 单孢扩繁时，应除去孢子表面游离的任何菌丝片段。菌丝片段的存在可能会造成污染。这种污染要到产孢或到第2-3代盆栽周期后才可能被发现。
4. 盆栽培养温度调控必须从两方面考虑：一是寄主植物生长的适宜温度，二是AM真菌生长的适宜温度。因此，培养室的最适温度应根据寄主植物的种类及AM真菌的种类而定，一般情况下最适温度应保持在寄主植物最适温度的上限，但最低温度不能低于15 °C。
5. 湿度是盆栽扩繁的重要因素，盆栽积水会导致培养物中滋生微生物和病虫，过度干旱胁迫会导致寄主植物不能正常生长。最好人工适量浇洁净的水，做到基质的干湿交替，尽量避免过湿或过干。
6. 所有培养过程中浇水时都要用洁净的水，浇水容器用水冲洗干净后再用；严禁浇水容器接触到培养基质表面或将基质或水泼溅到外面，以免造成盆栽之间的污染。
   

致谢

感谢北京市农林科学院科技创新能力建设专项 (KJCX20200104)；台州学院杰出青年项目 (2019JQ005) ；浙江省基础公益研究计划项目 (LGN19C150004) 和浙江省自然科学基金 (LTY22C030004) 的资助。本方法改编自王幼珊，张淑彬和张美庆老师出版的《中国丛枝菌根真菌资源与种质资源》。

参考文献

1. 王幼珊，张淑彬，张美庆. (2012). 中国丛枝菌根真菌资源与种质资源. 中国农业出版社. 北京. ISBN: 9787109165045.
2. 刘润进，陈应龙. (2007). 菌根学. 科学出版社. 北京.
3. 布伦德里特, M., 布格尔, N., 德尔, B., 格鲁夫, T., 马拉祖克, N., 著. 陈应龙，译. (2020). 农林业菌根研究技术. 科学出版社. 北京.
4. International Culture Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM). (Accessed October, 2021, at https://invam.wvu.edu/home)
5. Trejo-Aguilar, D. and Banuelos, J. (2020). Isolation and culture of arbuscular mycorrhizal fungi from field samples. Methods Mol Biol 2146: 1-18.
6. 刘士哲. (2001). 现代实用无土栽培技术. 中国农业出版社. 北京. ISBN: 7109067963.