实验原理:真核细胞mRNA最显著特征是具有5’–端帽子结构和3'–端的polyA尾巴。mRNA的polyA与oligo(dT)纤维素柱在高盐下亲和吸附。在低盐下吸附解除,因此可利用该原理分离mRNA,再用有机溶剂沉淀可得纯化mRNA。
实验目的:从水稻组织中分离纯化mRNA,可以用于逆转录,RACE和文库构建等后续实验。
关键词: 水稻, mRNA, 分离
材料与试剂
- 枪头及配套枪头盒:1 ml、200 μl、20 μl (AXYGEN)
- 离心管和配套管架:1.5 ml (AXYGEN)
- 50 ml离心管:分装氯仿、异丙醇和酒精
- 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
- 焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758)
- 苯酚:氯仿:异戊醇 (体积比25:24:1) 或氯仿 (国药试剂,分析纯)
- 异丙醇 (国药试剂,分析纯)
- 无水乙醇或95%乙醇 (国药试剂,分析纯)
- 75%乙醇 (用95%乙醇和0.1‰ DEPC处理过的H2O配制)
- TE缓冲液
- Tris-HCl
- 糖原 (Glycogen)
- NaAc
- Micro-FastTrackTM 2.0 Kit (Invitrogen, catalog number: K1520-02)
- 0.1‰ DEPC处理水 (见溶液配方)
仪器设备
- 研钵和研磨棒
- 移液器:1 ml、200 μl、20 μl、10 μl、2.5 μl (Eppendorf)
- 试剂瓶:250 ml
- 4 °C冷冻离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5417R)
- 紫外分光光度计:Nanodrop (Thermo Fisher)
- -80 °C冰箱
- 灭菌锅
- 计时器
- 平板摇床或混悬仪
实验步骤
- 液氮取样,按照“水稻组织总RNA抽提”抽提总RNA (25:24:1或氯仿抽提2次) (方玉洁等,2018)。
- 从总RNA中分离mRNA (每份总RNA > 600 μg)
- 清洗oligo(dT)纤维素
- 洗脱和沉淀mRNA
注意事项
- 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
- 提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量好的先决条件。
- 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA纯度降低。
- RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65 °C加热5 min,这一步很重要,其作用是:(1) 破坏mRNA的二级结构,特别是poly(A)尾巴处的二级结构,使poly(A)尾巴充分暴露,提高poly(A)RNA回收率;(2) 解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。
- 应注意mRNA分离时,防止DNA污染,微量DNA污染,将影响实验结果。
- 为防止mRNA降解,应避免多次冻融,可将mRNA少量分装后保存于-80 °C冰箱。此外,-70 °C条件下mRNA在70%乙醇中可保存一年以上。
- 分离得到的mRNA,要求A260:A280不小于2.0。
溶液配方
- 0.1‰ DEPC处理水
将DEPC按照1:10,000(体积比)加入双蒸水,搅拌8 h以上,根据需要可高温高压灭菌。
参考文献
- 方玉洁等. (2018). 水稻组织总RNA抽提方法. Bio-101 e1010111. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010111. (in press)
- Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162(1): 156-159.
- Chomczynski, P. (1993). A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques 15(3): 532-534, 536-537.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.