水稻叶片中黄酮类代谢产物的检测和鉴定
Detection and Identification of Flavonoid Metabolites in Rice Leaves   

材料与试剂

1. 离心管
   
2. 0.22 μm尼龙膜 (上海安谱科学仪器有限公司)
   
3. 各种型号的枪头
   
4. 色谱进样样品管
   
5. 甲醇和乙酸，色谱纯级别 (来自德国Merck公司)
   
6. 双蒸水

仪器设备

1. 色谱仪 (岛津UFLC shimADZU色谱仪)
   
2. 色谱柱 (shimpack VP-ODS，150 mm * 5 μm)
   
3. 涡旋仪
   
4. 4 °C冰箱
   
5. 离心机
   
6. -70 °C冰箱

实验步骤

1. 样品制备
   1.1

   取适量(3-5片)新鲜水稻叶片，液氮保存；
   
   1.2

   配制70%的甲醇溶液用于黄酮的提取；
   
   1.3

   在研钵中用液氮将水稻叶片磨成粉状后加入预冻好的离心管中，然后按1 g:1 ml的比例加入70%甲醇溶液，强烈涡旋10 s后将样品放入4 °C冰箱，每隔10 min再涡旋一次，重复3次后放入4 °C冰箱过夜。
   
   1.4

   次日用4 °C离心机10,000 rpm离心10 min后吸取上清，然后用0.22 μm尼龙膜将上清液过滤后装入色谱进样样品管中，放-70 °C冰箱保存，待测。
   
   
2. 按照以下所描述的仪器条件准备好仪器，以便对黄酮进行检测
   2.1

   高效液相色谱条件
   流动相：A(水相)为体积比为0.04%乙酸水溶液，B(有机相)为体积比为0.04%乙酸甲醇溶液，柱温40 °C，流速0.25 ml/min；
   进样量：5 μl；
   洗脱梯度：0.1 min = 25% B；15 min = 50% B；18-23 min = 75% B；23.1 min = 25% B；33 min = stop。
   
   2.2

   质谱条件
   质谱仪：AB API 4,000 Q TRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪。
   仪器参数：离子源：Turbo V；电离模式：ESI(+)
   
   
3. 建立一个多反应监测模式(MRM)的跑样方法，并按照(表1)内容导入所需要检测的黄酮物质
   
   表1.检测水稻叶片中常见15种黄酮的相关参数
   
   
   
4. 用已建立好的方法对要分析的样品进样跑样，完成后对结果进行分析

结果与分析

结果如图1所示，每个物质的保留时间及物质名称如表2所示


图1. 叶片中15种常见黄酮的峰图

表2.水稻叶片中15中常见黄酮的保留时间及物质名称

注意事项

1. 最终可以根据标样做标准曲线对这些黄酮进行绝对定量；也可以对峰面积进行积分从而在不同的水稻样品中进行相对定量，并进一步进行相对含量的比较和分析。
   
2. 如图2是Cyanidin 3-O-glucoside在几个常规品种剑叶中的相对含量分布，可以看出，ZS97中Cyanidin 3-O-glucoside的含量远远高于其他品种，甚至是有和无的差别，从表型观察我们也可以发现ZS97的叶缘为紫色，而其他几个品种为绿色，据报道，Cyanidin 3-O-glucoside正是导致水稻叶片颜色出现紫色最主要的物质之一。
   
   
   图2. Cyanidin 3-O-glucoside在几种常规品种剑叶中的相对含量分布

参考文献

1. Chen, W., Gong, L., Guo, Z., Wang, W., Zhang, H., Liu, X., Yu, S., Xiong, L. and Luo, J. (2013). A novel integrated method for large-scale detection, identification, and quantification of widely targeted metabolites: application in the study of rice metabolomics. Mol Plant 6(6): 1769-1780.
   
2. Gong, L., Chen, W., Gao, Y., Liu, X., Zhang, H., Xu, C., Yu, S., Zhang, Q. and Luo, J. (2013). Genetic analysis of the metabolome exemplified using a rice population. Proc Natl Acad Sci U S A 110(50): 20320-20325.