水稻种子总淀粉含量的测定
Determination of the Total Starch Content of Rice Seeds   

材料与试剂

1. 牙签
   
2. 10 ml离心管
   
3. 各种型号的吸头
   
4. 200目筛子
   
5. 水稻种子
   
6. 葡萄糖苷酶 (Amyloglucosidase, Sigma, catalog number: A7095, USA)
   
7. pH试纸 (Sigma, catalog number: 010B164536, USA)
   
8. 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) (Sigma, catalog number: G0550, USA)
   
9. 浓盐酸 (国药试剂, 分析纯)
   
10. NaAc (国药试剂, 分析纯)
    
11. KOH (国药试剂, 分析纯)
    
12. NaOH (国药试剂, 分析纯)
    
13. D型无水葡萄糖 (国药试剂, 分析纯)
    
14. Na₂SO₃ (国药试剂, 分析纯)
    
15. 重蒸酚 (国药试剂, 分析纯)
    
16. 酒石酸钾钠 (国药试剂, 分析纯)
    
17. 0.4 mol·L^-1醋酸钠缓冲液 (pH = 4.75)
    
18. DNS试剂(见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
   
2. 棕色试剂瓶
   
3. 离心机 (Eppendorf, model: centrifuge 5417R, USA)
   
4. 恒温摇床 (HDL，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)
   
5. 旋风式粉碎机 (Udy corporation, Colorado, USA)
   
6. 精米机 (JMJ-100型，铁岭精泰制米机械股份有限公司)
   
7. 电子天平 (OHAUS, USA)
   
8. 稻谷出糙机 (JLGJ4.5，台州市粮仪厂)
   
9. 涡旋振荡器 (敖然科技有限公司)
   
10. 水浴锅 (武汉金宝华科技有限公司)
    
11. 酶标仪 (TECAN Infinite M200)
    
12. 酶标板 (Nunclon 96 Flat Transparent)
    

实验步骤

1. 水稻种子成熟收获后晒干或者烘干，然后将种子进行脱粒处理。
   
2. 种子在室温保存3个月后利用稻谷垄谷机上脱壳得到糙米。
   
3. 将糙米在精米机上粉碎成精米。
   
4. 精米在旋风式粉碎机上粉碎成米粉。
   
5. DNS试剂的制备 (见溶液配方1)。
   
6. 样品葡萄糖的制备：称取过200目筛子的米粉样品50 mg (4个空白对照各加50 μl 蒸馏水) 于10 ml离心管中，用枪迅速加入6 ml 2.5 mol·L^-1 KOH(40 °C)，加牙签后在室温下震荡5 min，使淀粉充分溶解后40 °C水浴5 min后再室温下震荡5 min，直至无生淀粉团生成，去掉牙签；加入3 ml 0.4 mol·L^-1 醋酸钠缓冲液(pH = 4.75)，加入浓盐酸溶液(约800 μl)将样品溶液的pH值调至4.75；最后加入60 μl葡萄糖苷酶，于130 rpm转速摇床中在60 °C下作用45 min；之后再6,000 rpm 4 °C离心2 min，取上清稀释10倍后备用。用DNS法测定葡萄糖含量(见下所述)，50 mg样品中总淀粉的含量等于葡萄糖含量乘以0.9 (Goni等, 1996)。
   
7. 葡萄糖标准曲线的绘制：葡萄糖标准液梯度稀释(用蒸馏水稀释D型无水葡萄糖，各3个重复)：4,000 µg·ml^-1→2,000→1,000→500→250→125→62.5→0 µg·ml^-1，各吸取0.2 ml于2 ml离心管中，分别准确加入DNS试剂 (见溶液配方) 0.4 ml，沸水浴加热5 min，冰水混合物冷却5 min，再加1.4 ml的蒸馏水混匀，各吸取200 µl于96孔的白色酶标板中，用多功能酶标仪TECAN infinite M200在540 nm波长下测定吸光度。
   
8. 样品葡萄糖含量的测定：样品液及空白对照用蒸馏水稀释10倍后，使糖浓度为0.1-1.0 mg·ml^-1，各吸取稀释后的糖液0.2 ml于2ml 离心管中，分别准确加入DNS试剂0.4 ml，沸水浴加热5 min，冰水混合物冷却5 min，再加1.4 ml的蒸馏水混匀，各吸取200 µl于96孔的白色酶标板中，用多功能酶标仪在540 nm波长下测定吸光度，从标准曲线算出葡萄糖µg·ml^-1数，乘以10倍后求出样品中葡萄糖含量。
   
9. 打开并预热多功能酶标仪(测浓度可不用预热)，打开电脑→点击软件Magellan→ Create/edit a method→New/open→选Nunclon 96 plat Transparent→选96孔有样的孔→双击左侧Absorbance→选参数540 nm、预振次数、测样点的数目等→保存方法于自己文件夹中→点Start measurement→use predefined method→选你定的方法→开始→点Edit中copy to excel→保存excel于自己文件夹中→退出，保存Results文件。
   
10. 葡萄糖标准曲线及其方程式制备：将葡萄糖的OD值及待测样品的OD值均减去空白对照的OD值→对葡萄糖OD值做散点图→划趋势线→点击趋势线点公式及R2值，R2值越接近1，曲线的线性化越好。
    
11. 根据9步骤中方程式及待测样品的OD值减去空白对照OD值算出各样品稀释10倍后的葡萄糖浓度值。
    
12. 50 mg样品中总淀粉的含量(%)=葡萄糖浓度值(µg·ml-1)×10倍×9.11 ml×0.9/(50 * 1,000) (Goni等, 1996)。
    

注意事项

1. 米粉要过200目的筛子，以便取样均匀及酶解完全。
   
2. DNS和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH，否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。
   
3. 在DNS试剂的制备过程中，溶液加热温度不宜超过50 °C。
   

溶液配方

1. DNS试剂
   3.15 g DNS
   131 ml 2 mol·L^-1氢氧化钠
   加到250 ml含有91 g 酒石酸钾钠的热水溶液中
   加上2.5 g重蒸酚和2.5 g亚硫酸钠
   搅拌溶解，冷却后加水定容到500 ml (棕色瓶中备用)
   

参考文献

1. Goni, I., García-Diz, L., Mañas, E. and Saura-Calixto, F. (1996). Analysis of resistant starch: a method for foods and food products. Food Chemistry 56: 445-449.