活性氧检测
Reactive Oxygen Detection   

材料与试剂

1. 50 ml离心管
   
2. 10 ml离心管
   
3. 氮蓝四唑NBT (Sigma, USA, CAS: N5514)
   
4. 叠氮化钠 (Sigma, USA, CAS: S8032)
   
5. 1 M 磷酸缓冲液 (pH 7.8)
   
6. 95%乙醇
   
7. 1 M叠氮化钠溶液 (见溶液配方)
   
8. NBT染液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 真空干燥箱
   
2. 水浴锅
   

实验步骤

1. 配制NBT染液(见溶液配方)并分装入50 ml离心管。
   
2. 用剪刀剪取水稻叶片或其他组织，立刻放入装有NBT染液的50 ml离心管中。
   
3. 将离心管放入真空干燥箱内，打开管盖。关闭真空干燥箱门和排气口，打开真空泵抽出箱内空气，待负压表读数降至-0.1 MPa时关闭真空泵，保持负压30 min。
   
4. 打开排气口，恢复箱内气压，待气压稳定后取出离心管，于室温(25 °C)静置60 min。
   
5. 倒弃NBT染液，加入95%乙醇并浸没样品，将离心管置于80 °C水浴中脱色，每隔10min换一次95%乙醇，待样品的绿色全部褪去后将样品取出拍照记录染色结果。
   

溶液配方

1. 1 M叠氮化钠溶液
   称取0.6501 g叠氮化钠固体于10 ml离心管中，加入ddH₂O定容至10 ml
   
2. NBT染液
   称取0.05 g NBT于50 ml离心管中，加入500 μl 1 M叠氮化钠溶液和500 μl 1 M 磷酸缓冲液(pH 7.8)，加入ddH₂O定容至50 ml
   
   

第二部分：DAB染色检测过氧化氢

实验原理：当过氧化物酶存在时，二氨基联苯胺 (3,3’-diaminobenzidine, DAB) 被双氧水氧化生成不溶于水的暗棕色颗粒。
实验目的：定性、原位检测水稻各组织中的双氧水.
关键词：水稻，生理指标，活性氧，过氧化氢，二氨基联苯胺

材料与试剂

1. DAB (Sigma, USA, CAS: D8001)
   
2. 95%乙醇
   
3. 0.2 M HCl
   
4. DAB染液 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 真空干燥箱
   
2. 水浴锅
   

实验步骤

1. 配制DAB染液 (见溶液配方)，将离体的叶片浸入DAB染液。
   
2. 抽真空30分钟，使得叶片完全浸入DAB染液中。
   
3. 室温孵育过夜。
   
4. 用95%乙醇在80 °C水浴中脱色，拍照。
   

注意事项

NBT染色和DAB染色时，需注意取样部位的不同对定性结果造成的影响。例如，对不同胁迫环境下的同一批植株进行取样，最好取生长时期相同的植株上相同部位的叶片染色进行比较。

溶液配方

1. DAB染液
   在50 ml离心管中加入20 mg DAB和38 ml ddH₂O (或Tris-acetate buffer, pH 5.0)，0.2 M HCl调pH至以便DAB溶解，配成终浓度为0.5 mg/ml的DAB染液。
   注：DAB染液现配现用，避免自我氧化。
   
   
   

第三部分：过氧化氢定量测定

实验原理：当过氧化物酶存在时，过氧化氢和10-乙酰基-3，7-二羟基吩嗪(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, ADHP)在过氧化物酶催化下产生荧光产物试卤灵(resorufin)。用酶标仪对试卤灵进行测定可计算出过氧化氢的含量。
实验目的：定量测定水稻各组织中过氧化氢含量。
关键词：水稻，生理指标，过氧化氢

材料与试剂

1. 1.5 ml 离心管
   
2. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂)
   
3. 20 mM 磷酸缓冲液，pH 6.5
   
4. Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit (Molecular Probes, USA, CAS: A22188)
   

仪器设备

1. 离心机
   
2. 多功能酶标仪 (M200, Tecan, Mechelen, Belgium)
   
3. 酶标板
   

实验步骤

1. 水稻样品用液氮研磨，取0.1 g样品至1.5 ml离心管中，立即加入1 ml 4 °C预冷的20 mM磷酸缓冲液(pH 6.5)，充分震荡混匀。
   
2. 12,000 rpm低温4 °C离心10 min，上清液转入新的离心管中用于后续实验。
   
3. 按照试剂盒Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit (Molecular Probes)提供的方法对过氧化氢进行定量测定。