柑橘染色体涂片制片法
Preparation of Smear Slides for Observing the Chromosomes of Citrus   

材料与试剂

1. 盆
   
2. 吸水纸
   
3. 培养皿
   
4. 滤纸
   
5. 纱布
   
6. 2 ml离心管
   
7. 吸管
   
8. 载玻片
   
9. 柑橘果实
   
10. 饱和对二氯苯 (RT) 
    
11. 0.075 mol/L KCl (RT) 
    
12. 乙醇
    
13. 乙酸
    
14. 柠檬酸
    
15. 二水合柠檬酸三钠
    
16. ddH₂O
    
17. Pectinase (Aspergillus niger, Sigma-Aldrich, 4 °C) 
    
18. Cellulose (“Onozuka”RS, Yakult Pharmaceutical Industry, 4 °C) 
    
19. Pectolgase (Y-23, Yakult Pharmaceutical Industry, 4 °C) 
    
20. 10x EB (柠檬酸钠缓冲液) (见溶液配方) 
    
21. 酶混合液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 刀
   
2. 镊子
   
3. 手术刀
   
4. 打火机
   
5. 大头针
   
6. 28 °C培养箱
   
7. 水浴锅
   
8. -20 °C冰箱
   
9. 摇床
   
10. 解剖镜
    
11. 移液器
    
12. 相差显微镜 (Olympus, model: BH-2)
    

实验步骤

1. 取材和前处理
   1.1

   用刀将柑橘果实小心切开，取出种子，放入装有清水的盆中浸泡30-60 min，浸泡过程中搓洗种子2-3次，再平铺于吸水纸上晾干。
   注：因柑橘种子外表皮果胶较多，为方便剥掉种皮，需用清水搓洗，种子浸泡时间视果胶多少而定。
   
   1.2

   在培养皿中平铺两张滤纸，用清水浸湿，上面盖上2-3层纱布，再用清水浸湿。种子剥掉内外种皮，均匀摆放在纱布上，加清水至半浸没种子。28 °C避光培养7-10 d (视根尖生长情况而定)，期间不间断观察，水干后及时续加。
   注：
   1)种子摆放于纱布上时，不宜太过密集，不利于萌发，应保持2-3 cm的间距。待初生根生长到1 cm左右时，解剖刀切取根尖前端3-5 mm，用镊子放入装有蒸馏水的2 ml离心管中，置于冰上。
   2)当根尖生长短于1 cm时，分生组织活动最为旺盛，易于得到正在分裂的染色体。
   3)取根尖时，至少小于5 mm，切口更接近于分生区，利于溶液的吸收。
   4)根尖最好置于底部较平的2 ml离心管中，利于吸收试剂，每个离心管中根尖条数不能多于15条。
   
   1.3

   取完根尖后，吸管轻轻吸出水，再加入饱和对二氯苯溶液，20 °C水浴3 h。吸出饱和对二氯苯溶液，加入0.075 mol/L KCl室温处理30 min，再换新制卡诺固定液 (乙醇:乙酸 = 3:1) 常温固定24 h。固定后用70%乙醇4 °C保存备用，长期储存在-20 °C。
   注：对根尖进行预处理时，会经常更换试剂，因根尖较小，容易吸出，需小心谨慎。对二氯苯对细胞代谢活动的毒害是较大的，预处理液的温度过高或处理时间过长，很容易导致产生染色体断裂、黏连等类似辐射畸变的效应。
   
2. 酶解根尖
   2.1

   用镊子将固定好的根尖取出放入柠檬酸钠缓冲液中，置摇床上中低速摇3-5次，5 min/次，每次均需换柠檬酸钠缓冲液。
   注：因从卡诺固定液中取出的根尖吸取了大量的乙醇，为保证酶解充分，需用柠檬酸钠缓冲液清洗至少3次。
   
   2.2

   解剖镜下切除根尖至2-3 mm，滤纸吸干根尖水分，用镊子轻轻放入装有酶混 合液的2 ml离心管中，每管最多有4条根尖，酶液40-60 µl。37 °C水浴90 min左右，根尖上部处于透明弥散状态即表明已酶解好。
   注：根尖水分尽量吸干，酶液中放入根尖时，不要用镊子搅动，以免浪费酶 液。根尖放入酶液后，确保没有粘在管壁上，确保酶解充分。
   
3. 涂片制片
   3.1

   在酶解好的根尖中缓慢加入柠檬酸钠缓冲液或ddH₂O稀释，终止酶解。
   注：酶解后的根尖已经软化，极易破碎，所以不能剧烈晃动。
   
   3.2

   用吸管慢慢将根尖移到预先晾干的干净载玻片中间区域，在解剖镜下仔细地用大头针解剖根尖，去掉杂质和不能解开的材料块，留下乳白色区域。
   
   3.3

   用吸管和干净的滤纸吸走多余的水份和杂质，大头针垂直轻轻敲打根尖至匀浆状。在根尖周围用移液枪滴加约10 µl新配制的60%乙酸，大头针再轻轻敲打至混匀。移液枪悬空滴加1~2滴约15 µl (视根尖大小而定) 新配置的卡诺固定液 (乙醇:乙酸=3:1) 展片，用打火机立刻点燃固定液，待固定液干燥后即完成制片。一般来说火焰燃烧能够最大程度的将分裂相展开。用相差显微镜20倍下检测，选择染色体分裂相好且多，杂质较少的染色体片，-20 °C保存备用。
   注：

   1)

   用吸管和滤纸吸走水分时，不能完全吸干，要保留一点水分，便于后续展片。 
   

   2)

   大头针敲打根尖时，也可看出是否酶解充分，若一敲即化，无碎渣，则表示已经酶解好。
   

   3)

   60%乙酸和卡诺固定液需放在冰上，悬空滴加卡诺固定液时，不宜太高，防止细胞过于分散。
   

溶液配方

1. 10x EB (柠檬酸钠缓冲液) 
   
   
2. 酶混合液
   2.1

   母液
   
   
   2.2

   工作液
   
   

参考文献

1. 苗茵, 徐凤娇, 兰红, 陈春丽. (2014). 沙田柚实生苗染色体的荧光显带分析. 华中农业大学学报 33(01): 18-23.
2. Lan, H., Chen, C. L., Miao, Y., Yu, C. X., Guo, W. W., Xu, Q. and Deng, X. X. (2016). Fragile Sites of 'Valencia' Sweet Orange (Citrus sinensis) Chromosomes Are Related with Active 45s rDNA. PLoS One 11(3): e0151512.