柑橘果实类胡萝卜素提取与检测
Extraction and Detection of Carotenoids from Citrus Fruits   

材料与试剂

1. 塑料吸管
   
2. 10 ml离心管
   
3. 50 ml离心管
   
4. 1 ml注射器
   
5. 0.22 μm有机滤膜 (抽滤流动相用)
   
6. 0.22 μm滤膜 (过滤提取液用)
   
7. Waters717检测器专用进样瓶
   
8. 玻璃内插管
   
9. 柑橘干样
   
10. 正己烷 (分析纯)
    
11. 丙酮 (分析纯)
    
12. 无水乙醇 (分析纯)
    
13. 10% NaCl
    
14. 甲基叔丁基醚 (Methyl t-Butyl Ether, MTBE, 色谱纯)
    
15. BHT (2,6-Di-bert-buty-4-methyl-phenol)
    
16. 甲醇 (Methanol, 色谱纯)
    
17. 乙腈 (Acetonitrile, 色谱纯)
    
18. 类胡萝卜素提取液 (见溶液配方)
    
19. 10% NaCl (见溶液配方)
    
20. 10% KOH-甲醇皂化液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 涡旋仪
   
2. 磨样机
   
3. 分液漏斗
   
4. 超声仪
   
5. 旋转蒸发仪 (Eppendorf, 德国)
   
6. 真空抽滤仪
   
7. 大型离心机
   
8. 小离心机
   
9. Waters高效液相色谱仪 (HPLC，high performance liquid chromatograph): 1525液相色谱泵系统、717自动进样器、2996二极管阵列检测器和Empower 2色谱管理软件，反向色谱柱C30 carotenoid column (长柱250 x 4.6 mm/短柱150 x 4.6 mm; YMC, Japan)
   

实验步骤

1. 分别称取成熟柑橘干样1-3 g (红肉1 g, 白肉3 g；鲜样果肉粉末白肉品种10 g，红肉看色泽深度2-6 g不等，黄肉5 g；果皮粉末1-2 g) 置于50 ml离心管 (白色螺纹进口)。
   
2. 加15 ml类胡萝卜素提取液，涡旋混匀。
   
3. 磨样机剧烈震荡6分钟后4,000 x g离心10 min，转移上清至另一50 ml离心管 (普通离心管即可)，沉淀用15 ml色素提取液重复提取两次至无色 (共提取三次，上清转移至同一离心管中)。
   
4. 合并上清液，上清在50 ml的分液漏斗中用饱和NaCl (10%) 水溶液反复洗三次至中性，弃下层 (水层)。
   
5. 将上清分批次转移至10 ml离心管中，真空浓缩干。真空浓缩后用2 ml MTBE (含0.1‰ BHT) 溶解，再加2 ml 10% KOH-甲醇溶液 (含0.1‰ BHT)，避光条件下皂化10 h。
   
6. 加4 ml饱和NaCl水溶液和2 ml MTBE (含0.1‰ BHT) 使之更好的分层，用胶头吸管吸走水层，再加3次5 ml饱和NaCl水溶液洗至中性。
   
7. 将剩下的色素上清液分批次转移至2 ml离心管中，真空浓缩至干 (可暂时保存于-80 °C冰箱，待检测前再溶解)，再用0.15-1 ml (浓度低的可只加0.15 ml，可以过滤膜) MTBE溶解定容。
   
8. 15,871 x g离心30 min，过滤膜，转移到进样瓶中，高效液相色谱检测。
   
9. 流动相的配制: A. 乙腈:甲醇=3:1 (750:250 ml，含0.01% BHT)；B. 100% MTBE (含0.01% BHT)。
   
10. 配好后分别用加有0.22 μm有机滤膜的真空抽滤仪，抽滤流动相，除去杂质。
    
11. 流动相放超声仪中，超声30 min，除去气泡。
    

注意事项

1. 以上色素提取，皂化等各操作均在弱光或避光条件下进行。
   
2. 柑橘红色果肉中的番茄红素，易结晶，一定要充分稀释后再上样，否则容易堵柱子。
   
3. 最后如果仅用0.15 ml的MTBE溶解时，用注射器加滤膜过滤提取液时，一定要在吸取提取液后多吸一段空气，并在操作台上干净的位置轻轻敲打，使液体充分进入滤膜后，在打进内插管，以保证把所有提取液都打进内插管中。
   
4. HPLC的使用
   1)

   流动相：流速为1 ml/min，进样量20 µl。
   

   2)

   采用梯度洗脱：0 min: A-B(95:5); 0-10 min: A-B (95:5); 10-19 min: A-B (86:14); 19-29 min: A-B (75:25); 29-54 min: A-B (50:50); 54-66 min: A-B (26:74); 67-76 min: A-B (95:5)。
   

   3)

   数据分析：在304 nm波长看八氢番茄红素的结果，436 nm下看六氢番茄红素的结果，其余物质均可在450 nm下查看。
   
5. 标准品峰图 (图1)
   
   
   图 1. 标准品峰图
   
   
6. 标准品定性信息
   
   

溶液配方

1. 类胡萝卜素提取液
   正己烷:丙酮:无水酒精=2:1:1 (500 ml, 250 ml, 250 ml; 含0.1‰ BHT)
   
2. 10% NaCl
   100 g NaCl加到1 L纯水中
   
3. 10% KOH-甲醇皂化液 (100 ml)
   10 g KOH，加25 ml超蒸水，再加75 ml甲醇