柑橘果实糖酸含量测定
Determination of Sugar and Organic Acid Contents in Citrus Fruits   

材料与试剂

1. 枪头
   
2. 2 ml离心管
   
3. 10 ml离心管
   
4. 2 ml上样瓶 (GC专用)
   
5. 柑橘果汁或冻样
   
6. 糖
   
7. 葡萄糖
   
8. 果糖
   
9. 肌醇
   
10. 苹果酸
    
11. 柠檬酸
    
12. 奎宁酸
    
13. 六甲基二硅胺烷 (hexamethyldisilazane, HMDS)
    
14. 三甲基氯硅烷 (trimethylchlorosilane, TMCS)
    
15. 盐酸羟胺
    
16. 甲醇
    
17. 吡啶
    
18. 浓硫酸
    
19. 甲基-α-D-葡萄糖苷 (methl-α-D-Glucopyranoside, Sigma-Aldrich)
    
20. 纯蒸水
    

仪器设备

1. 容量瓶 (1 ml，2 ml，4 ml，8 ml，16 ml，50 ml)
   
2. 量筒
   
3. 三角瓶
   
4. 离心管架
   
5. 电子秤
   
6. Agilent 7890A气相色谱仪
   
7. 气相色谱自动进样器
   
8. 安捷伦气相色谱系统化学工作站
   
9. 氢火焰离子化检测器
   
10. Effendorf真空旋转浓缩仪
    
11. Effendorf高速离心机
    
12. 水浴锅
    
13. 超声波仪器
    
14. -80 °C超低温冰箱
    
15. 4 °C冰箱
    
16. 研磨设备
    
17. 通风橱
    
18. 移液器
    

实验步骤

1. 定性分析
   准确称取苹果酸、柠檬酸、奎宁酸、果糖、蔗糖、葡萄糖、肌醇各0.0100 g，分别溶于100 ml的重蒸水中，取0.5 ml于2 ml离心管中，真空旋转浓缩仪于45 °C干燥至无水状态。
   干燥后进行衍生化反应，加入0.8 ml盐酸羟胺溶液，于70 °C反应1 h，冷却至室温，依次加入六甲基二硅胺烷 (HMDS) 0.4 ml，三甲基氯硅烷 (TMCS) 0.2 ml。然后取0.5 ml上清液至2 ml自动进样瓶，进行GC-FID分析，通过各个成分的保留时间定性。
   注：六甲基二硅胺烷和三甲基氯硅烷为购买药品，无需进行配置。
   
2. 标准曲线的绘制
   根据果实中各成分的含量，准确称取1.0000 g果糖、1.0000 g葡萄糖、2.0000 g蔗糖、0.3000 g柠檬酸、0.1000 g苹果酸、肌醇和奎宁酸，用80%甲醇溶解并定容至100 ml，分别移取上述溶液1 ml、2 ml、4 ml、8 ml和16 ml于50 ml容量瓶中，分别准确加入1 ml内标 (甲基-α-D-葡萄糖苷，methl-α-D-glucopyranoside，10 g/250 ml) 并用80%甲醇定容，然后按步骤1进行衍生化并进样分析，根据5个浓度梯度的色谱图，用气相色谱工作站，建立标准曲线并得出相关系数等指标。
   注：内标的配制：称取10 g的甲基-α-D-葡萄糖苷溶于双蒸水中，并用250 ml的容量瓶定容。各个标样的配置：按要求称取相应的克数用80%甲醇溶解并定容至100 ml。
   
3. 柑橘果实中糖酸的提取测定
   称取研磨的柑橘果肉1 g或果汁1 ml于10 ml离心管中，加入80%甲醇，置于70 °C恒温水浴锅30 min，取出冷却。超声波萃取90 min，4,000 x g离心10 min后，收集上清液，并入10 ml容量瓶中加入0.2 ml内标 (2.5 g溶于100 ml水)，定容摇匀。取2 ml于2 ml离心管中，13,523 rcf离心15 min。取0.5 ml上清液用真空旋转浓缩仪于60 °C干燥至无水状态。
   然后按步骤1进行衍生化并进样分析，进行GC-FID分析，通过各个成分的保留时间定性定量，记录样品中糖酸含量。
   
4. 糖酸的GC-FID分析的色谱条件
   气相色谱 (GC) 的分析参数依据Bartolozzi et al. (1997) 与曾祥国 (2005) 设定，略有改动。气相色谱的工作条件如下：HP-5色谱柱 (5%-Phenyl-methyl polysiloxane. 30 m x 320 μm i.d. x 0.25 μm)，分流/不分流进样口温度270 °C；检测器温度300 °C；高纯氮作载气，流量25 ml/min，H₂流量30 ml /min，空气流量400 ml/min，柱头压12.00 psi，进样量1 μl，分流比30:1，升温程序：初温130 °C，以8 °C/min升至152 °C，12 °C/min升至176 °C，16 °C/min升至198 °C，20 °C/min升至238 °C，24 °C/min升至280 °C，并在280 °C保温4 min。
   
5. 关机
   实验结束后，调出提前编好的关机方法，降温各热源 (Oven temp，Inlet temp，Det temp)，关闭FID气体 (N₂，H₂，Air)；将此方法下传至7890A。待各处温度降下来后 (低于50 °C)，退出化学工作站，退出Windows所有的应用程序；关闭PC；关7890A电源，最后关载气。实验完毕后进行登记，并整理各种实验用品。
   

结果与分析

注意事项

1. FID是用氢气在空气燃烧所产生的火焰使被测物质离子化的，故应注意安全问题。在未接上色谱柱时，不要打开氢气阀门，以免氢气进入柱箱。测定流量时，一定不能让氢气和空气混合，即测氢气时，要关闭空气，反之亦然。无论什么原因导致火焰熄灭时，应尽量关闭氢气阀门，直到排除了故障重新点火时，再打开氢气阀门。
   
2. 为防止检测器被污染，检测器温度设置不应低于色谱柱实际工作的最高温度。检测器被污染的影响轻则灵敏度明显下降或噪音增大，重则点不着火。
   
3. 糖酸的测定为液体进样，为了防止进样针的堵塞导致针的损坏，要及时更换洗针液(色谱纯甲醇)。
   
4. 一定要保证样品浓缩干，在整个衍生化和硅烷化过程中，一定保证样品、药品、离心管等的干燥，取衍生化和硅烷化好的上清液于上样瓶中时，速度要快，保证上清液不被氧化。
5. 样品测定完后，要及时清洗样品瓶，切记在通风橱内进行，将剩余样品导入废液缸，将用过的上样瓶等用稀硫酸浸泡，并放在通风橱内吹2个小时，味道散尽再进行清洗。
   

致谢

感谢Bartolozzi et al. (1997)、曾祥国 (2005)、顾建芹 (2007) 等人在方法上的摸索及改进。

参考文献

1. 霍月青. (2007). 砂梨品种资源糖酸及石细胞含量特点研究. [硕士学位论文]．武汉：华中农业大学.
   
2. 苏凤仙. (2006). 气相色谱技术的新进展及应用. 合成技术及应用 21(3):30-34
   
3. 王静, 王晴, 向文胜. (2001). 色谱法在糖类化合物分析中的应用. 分析化学 (评述与进展) 29(2): 222-227.
   
4. 项徐伟, 吴鹏. (2006). 毛细管气相色谱法衍生化的最优催化剂. 环境科学与技术 29(增刊): 52-53.
   
5. 杨小玲. (2005). 气相色谱衍生试剂的研究进展. 中国科技信息 7:25,15
   
6. 曾祥国. (2005). 不同种类和产区柑橘糖酸含量及组成研究. [硕士学位论文]．武汉：华中农业大学.
   
7. 张志良主编. (1990). 植物生理学实验指导 (第2版). 北京: 高等教育出版社 117-150.
8. Bartolozzi, F., Bertazza, G., Bassi, D. and Cristoferi, G. (1997). Simultaneous determination of soluble sugars and organic acids as their trimethylsilyl derivatives in apricot fruits by gas-liquid chromatography. J Chromatogr A 758(1): 99-107.