柑橘果实总蜡和外蜡的提取及测定
Extraction and Determination of Total Wax and Cuticular Wax of Citrus Fruits   

材料与试剂

1. 毛刷
   
2. 滤纸
   
3. 10 ml离心管
   
4. 1 ml注射器
   
5. 0.22 µm微孔滤膜
   
6. 气相质谱上样瓶
   
7. 柑橘果实
   
8. 蒸馏水
   
9. 三氯甲烷
   
10. 正二十四烷
    
11. 无水硫酸钠
    
12. 吡啶
    
13. BSTFA: N,O-双 (三甲基硅烷基) 三氟乙酰胺 (N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamid)
    
14. 正二十四烷内标溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 游标卡尺
   
2. 1 L烧杯
   
3. 100 ml蓝盖瓶
   
4. 分液漏斗
   
5. -20°C冰箱
   
6. 烘箱
   
7. 氮气吹干仪
   
8. 玻璃内插管
   
9. 气相色谱-质谱联用 (Thermo，DSQⅡ)
   
10. TR-1ms毛细管柱
    
11. EI离子源
    

实验步骤

1. 选取果面光洁，无破损，大小一致的果实用清水洗净，然后在蒸馏水中润洗3次，晾干。 
   
2. 果实表面积测定：本方法通过建立果实表面积与横纵径相关模型，以果实横纵径推算果实表面积。温州蜜柑、椪柑、柠檬、纽荷尔脐橙及沙田柚果实表面积与横纵径相关模型参见王金秋 (2015) 博士毕业论文。
   
3. 总蜡提取：在1 L烧杯中加入300 ml三氯甲烷，每个果实浸泡2 min，其中轻微振荡烧杯。所有果实脱蜡处理两次，将两次含有蜡液的三氯甲烷溶液混合在一起，加入200 μl(1 μg/μl)正二十四烷内标。
   
4. 外蜡提取：阿拉伯胶粉用三氯甲烷去除杂质后，配成浓度为90% (w/v)的乳浊液，用毛刷将其均匀地涂在柑橘果实表面，室温放置5 h左右，剥离干燥的阿拉伯树胶。以上步骤重复一次，并将将两次获取的阿拉伯胶研磨均匀，取其中16 g粉末，溶解于25 ml双蒸水中。按照水：三氯甲烷(v/v)1:3加入三氯甲烷，随后加入100 μl (1 μg/μl) 正二十四烷内标，剧烈振荡，直到阿拉伯树胶完全溶解为止；静置一段时间，待分层后，用分液漏斗取下层三氯甲烷澄清液，并用滤纸过滤。
   
5. GC-MS 样品制备：总蜡和外蜡三氯甲烷溶液中加入等量的无水硫酸钠，过滤后用氮气吹干仪在40 °C下吹至剩余15 ml液体左右，平均分到两个干净的10 ml离心管中，氮气下吹干放置入-20 °C冰箱中。留一份备用。每个样品取其中一份加入200 μl吡啶，50 °C于烘箱中孵育30 min，加入等体积的BSTFA，60 °C孵育40 min。氮气吹干多余的衍生化试剂，加入2.5 ml三氯甲烷定容。用孔径0.22 μm的针筒微孔滤膜过滤至玻璃内插管中，用于GC-MS测定。
   
6. GC-MS测定条件：气相色谱-质谱联用 (Thermo，DSQⅡ)，TR-1ms毛细管柱 (100% 二甲基聚硅氧烷，30 m x 25 μm i.d. x 0.1 μm)，EI离子源(70 eV)，扫描范围50~650 m/z，进样口温度250 °C，离子源温度300 °C，传输线温度250 °C，氦气为载气，流量为1.2 ml/min；程序升温：70 °C起始，以10 °C/min升至200 °C，保持2 min，2 °C/min升至285 °C，1 °C/min升至290 °C，2 °C/min升至300 °C，保持10 min, 3 °C/min升至320 °C，保持20 min；分流比10:1；自动进样，进样量1 μl。
   

注意事项

1. 剥去外蜡时一定小心，防止损失。
   
2. 内标一定要在蜡质提取后立即加入。
   

溶液配方

1. 正二十四烷内标溶液：浓度为1 μg/μl，溶剂为氯仿