草莓细胞壁物质测定
Extraction and Determination of Cellulose and Pectin in Strawberry Cell Wall   

材料与试剂

1. 草莓
2. 乙醇
3. Tris酚 (华佰泰生物)
4. 氯仿 (北京化工)
5. 甲醇 (北京化工)
6. 丙酮 (北京化工)
7. KOH
8. NaBH₄
9. Tris
   
10. HCl
    
11. CDTA
12. α-淀粉酶
13. 四硼酸钠
14. 浓硫酸 (北京化工) 
15. NaOH
16. D-半乳糖醛酸 (标样)
17. 葡萄糖 (标样)
18. 50 mM 乙酸溶液 pH 6.5
19. 4%KOH (0.1%NaBH₄)
20. 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0)
21. 0.15%间羟基联苯 (用0.5%的NaOH溶解)
22. 50 mM CDTA-乙酸钠 (见溶液配方)
23. 50 mM 碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液(见溶液配方)
24. 0.48%四硼酸钠-硫酸 (见溶液配方)
25. 蒽酮-硫酸 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
2. 研磨器具
3. 34 °C烘箱
4. 离心机
5. 4 °C冰箱
6. 透析袋 (留存分子量3,500，购自Biotopped，美国)
   

实验步骤

1. 细胞壁干物质的提取
   参照Brummell et al. (2004) 的方法。取果肉10 g，研磨后加入50 ml 80%的乙醇溶液混匀后过滤，收集沉淀，向沉淀中加入100 ml 80%的乙醇溶液，并混匀。过滤，沉淀加入40 ml Tris酚 (pH 7.0)，混匀之后在室温下放置30 min。(再加入100 ml 80%乙醇，放入-20 °C反应1 h，过滤，再用100 ml 95%乙醇洗一遍-可省略) 过滤，沉淀加入100 ml 氯仿:甲醇 (1:1) 溶液反应30 min室温，混匀之后过滤，沉淀加入100 ml 丙酮溶液洗涤，过滤得到沉淀，将沉淀放在34 °C烘箱中12 h，得到细胞壁干物质。称并记录干物质质量。
   注：该过程需要大量有机试剂，气味重，且有一定毒性，建议戴口罩，在通风橱进行试验。
2. 果胶和纤维素的提取
   
   1)

   参考Rose et al. (1998) 的方法。取干物质100 mg，加入20 ml 50 mM的乙酸溶液 (pH 6.5)，室温下反应24 h，离心得到上清液，取1 ml定容至10 ml即为水溶性果胶。
   2)

   在剩余沉淀加入20 ml 的 50 mM CDTA-乙酸钠 (pH 6.5) (见溶液配方1)，室温下反应24 h，离心10,000 x g 15 min，上清液定容至25 ml，取1 ml进行透析24 h，将透析液定容至5 ml，得到即为离子型果胶。
   注：透析前，检测透析袋是否漏水；透析袋呈管状，透析前先用夹子封好一侧，在加完透析液后将另一侧封好，用挂牌做好标记，放进纯水中透析，最好用磁力搅拌器加速透析，最好每隔2 h换一次水，使透析充分。
   3)

   在剩余沉淀加入20 ml 的 50 mM 的碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液 (见溶液配方2)，4 °C反应24 h (4 °C 18 h，室温2 h)，离心，(上清液在冰上用乙酸进行中和，之后定容至50 ml，取1 ml透析24 h) 透析得到共价性果胶。
   4)

   在剩余沉淀加入20 ml 4%KOH (0.1% NaBH₄)，室温下反应48 h，离心上清液加入2倍体积的无水乙醇在4 °C中过夜沉淀，之后离心弃掉上清液，沉淀加入10 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0) 含30个单位的α-淀粉酶，室温下反应24 h，取1 mL透析得到的溶液即为易溶性半纤维素。
   注：α-淀粉酶要现用现配。
   5)

   在剩余沉淀加入20 ml 24%KOH，室温下反应48 h，离心上清液加入2倍体积的无水乙醇在4 °C中过夜沉淀，之后离心弃掉上清液，沉淀加入10 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0) 含30个单位的α-淀粉酶，室温下反应24 h，取1 ml透析得到的溶液即为难溶性半纤维素。
   注：α-淀粉酶要现用现配。
   6)

   最后剩余沉淀用去离子水洗2遍，65 °C烘箱烘干即为纤维素。
   注：沉淀要充分洗净，否则干燥后易出现盐结晶。
3. 果胶和纤维素的测定
   1)

   参照Blumenkrantz and Asboe-Hansen (1973) 的方法，取1 ml 的提取液加入6 ml 的0.48%四硼酸钠-硫酸溶液 (见溶液配方3) 混匀，煮沸10 min ，冷却至室温后加入100 μl 0.15%间羟基联苯 (用0.5%的NaOH溶解) 溶液，对照样品加入100 μl 0.5%NaOH溶液，立即混匀，室温放置40 min，在波长520 nm处测定吸光度。用1 ml的去离子水用上述方法操作得到空白对照调零。以D-半乳糖醛酸做标准曲线，结果以mg/g表示。
   注：在样品中加入四硼酸钠-硫酸溶液后，盖紧试管塞，上下摇晃混匀；操作浓硫酸时注意安全。
   2)

   用蒽酮硫酸法测定半纤维素含量。取2 ml提取液加入5 ml蒽酮-硫酸 (见溶液配方4)，混匀后在沸水中煮沸10 min，冷却至室温后在波长620 nm处测定吸光度，用2 ml去离子水用上述方法操作得到空白对照调零。以葡萄糖做标准曲线，结果以mg/g表示。
   注：在样品中加入蒽酮-硫酸后，盖紧试管塞，上下摇晃混匀；操作浓硫酸时注意安全。
   

结果与分析

1. 在520.0 nm下，不同处理后草莓果实吸光值由标准曲线转化后的数据 (表1)
   
   表1. 不同处理草莓果实水溶型果胶含量
   
   

溶液配方

1. 50 mM CDTA-乙酸钠
   50 mM CDTA，用乙酸钠溶解并定容
2. 50 mM 碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液
   50 mM 碳酸钠，加入母液CDTA至终浓度为2 mM
3. 0.48%四硼酸钠-硫酸
   

   2.4 g	四硼酸钠
   500 ml	硫酸

4. 蒽酮-硫酸 
   

   0.25 g	蒽酮
   100 ml	浓硫酸

致谢

感谢国家自然基金 (31370323) 的支持。

参考文献

1. Blumenkrantz, N. and Asboe-Hansen, G. (1973). New method for quantitative determination of uronic acids. Anal Biochem 54(2): 484-489.
2. Brummell, D. A., Dal Cin, V., Crisosto, C. H. and Labavitch, J. M. (2004). Cell wall metabolism during maturation, ripening and senescence of peach fruit. J Exp Bot 55(405): 2029-2039.
3. Rose, J. K., Hadfield, K. A., Labavitch, J. M. and Bennett, A. B. (1998). Temporal sequence of cell wall disassembly in rapidly ripening melon fruit. Plant Physiol 117(2): 345-361.