实验名称：在AML细胞系中鉴定ENTV6-NTRK3融合基因
试剂盒名称：KAPA Stranded RNA-seq Kit with RiboEraseVendor   

[KAPA NGS产品在肿瘤研究中的应用] 下一代测序技术 (NGS)，又称为大规模平行测序技术，通常指第二代和第三代测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在肿瘤研究尤其是肿瘤诊断 (肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌) 及个体化用药治疗上的应用变为可能。
        构建高质量文库是运用NGS技术进行科学/临床研究的第一步也是非常关键的一步。进行肿瘤研究的文库类型主要有以下5种：全基因组测序 (WGS) (针对DNA)、全外显子组测序 (WES) (针对DNA)、全转录组测序 (针对RNA的RNA-seq)、 表观组测序 (甲基化及ChIP-seq)和靶向靶标测序 (DNA和RNA)。
        在科研及临床研究中，用于肿瘤相关研究的原始样品主要包括：FFPE样品、体液、单细胞、游离核酸等。从样品中分离出的用于文库构建的核酸起始样品量比较低 (通常1 ng 到几百ng 不等)，且核酸分子质量不高 (降解、损伤)。这些都对构建达到测序标准的高质量文库提出了挑战。
        Roche KAPA文库制备试剂为通过NGS进行肿瘤研究提供了整套解决方案 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。KAPA人类基因组DNA定量及QC试剂盒可以在单次检测中同时评估样本量及样本质量，严防谨守助力深度测序；Roche DNA文库构建试剂盒 (KAPA HyperPrep Kit, KAPA HyperPlus Kit) 及RNA文库构建试剂盒 (KAPA RNA HyperPrep Kit) 等试剂盒具有操作极简 (一管到底)，建库快速 (单日内可完成)，文库质量和得率双高等优点；文库定量试剂盒 KAPA Library Quant Kit质量同监，为测序把好最后一道关；而mRNA-capture Kit、RNA-Seq with RiboErase和纯化磁珠对目标核酸分子的富集可有效降低测序成本。这些试剂盒可有效帮助用户获得稳定可靠的测序结果，为后期的科学实验验证及临床研究提供可信的数据依据。 (测序中国, 案例解析： 定向进化的KAPA酶，从困难样本获得高质量NGS数据的“灵魂”)

研究背景

原肌球蛋白受体激酶 (TRK) 家族受体酪氨酸激酶、TRKA、TRKB和TRKC分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码。对目前已有的血液肿瘤的基因组分析表明，在包括急性髓性白血病 (AML) 在内的血液恶性肿瘤中，会存在着低频率的NTRK重排。并且在小鼠模型中的研究也表明，小鼠骨髓中若表达ETV6-NTRK3融合基因可导致一种类似AML的快速致命性骨髓增生性疾病。ETV6-NTRK3在小鼠乳腺上皮细胞中的表达会导致具有高侵袭性、多灶性乳腺肿瘤的快速发展。这些体外和体内实验为NTRK基因重排是致癌的驱动因素提供了强有力的数据支持。

生物材料：IMS-M2细胞系和M0-91细胞系

实验目的

利用Kapa RNA HyperPrep with Riboerase试剂盒构建IMS-M2细胞系和M0-91细胞系的转录组文库，分析得到其NTRK基因重排的情况，为后续研究提供基础。

关键词：急性髓性白血病 (AML)，融合基因，RNA-seq

实验步骤

1. 总RNA提取：使用Qiagen AllPrep试剂盒提取IMS-M2细胞系和M0-91细胞系总RNA。
2. RNA建库：取300 ng总RNA做为建库起始材料，参照KAPA Stranded RNA-Seq Kit with RiboErase建库说明书进行建库操作。大致流程如下：
   
   1)

   rRNA/球蛋白mRNA与寡核苷酸的杂交反应及RNase H处理去除
   2)

   磁珠纯化出RNA
   3)

   DNA酶消化去除RNA中的杂交寡核苷酸
   4)

   磁珠纯化
   5)

   RNA洗脱、片段化和预备
   6)

   选取100-200 bp的RNA进行建库
   7)

   反转录（1^st 链合成，2^nd 链合成）、加A、加连接头
   8)

   11个循环的PCR扩增获得测序文库
3. 在高灵敏度生物分析仪芯片上对最终文库进行定量。
4. 在Illumina NextSeq 500平台上进行测序分析。
5. 将获得测序数据比对到人基因组上, 通过生物信息学分析基因融合情况。
   

实验结果

RNA-seq 数据分析结果表明，在两个细胞系IMS-M2 和M0-9中，ETV6的外显子1-4与NTRK3的外显子15融到了一起。而在实体瘤中，融合情况更加多样，ETV6的外显子1-5分别与NTRK3的外显子14、15融合到了一起。ETV6的外显子1-4与NTRK3的外显子14融合到了一起 （见原文中的Fig1A）。
        RNA-seq 数据分析结果（见原文中的Fig1B）显示在IMS-M2和M0-91两个细胞系中仅表达NTRK3基因外显子15-20，并非表达全部的外显子。而NTRK1基因的全部外显子在两种细胞系中均表达。以上证实了之前的观察。NTRK3在这些细胞系中并非表达全长的mRNA，也说明NTRK3确实更易发生基因融合。
        文章中作者亦通过RNA-seq 数据分了其他致癌驱动基因的表达情况，如TRK, NGF、NTF3、NTF4 等等，结果表明TRK配体表达极低，NGF、NTF3、NTF4等不表达 (见原文中的Supplemental Fig1C)。这也证明了ETV6-NTRK3在IMS-M2和M0-91细胞系中都是致癌的驱动因素。

参考文献

1. Smith K M , Fagan P C , Pomari E , Germano, G., Frasson, C., Sliverman, I., Bonvini, P. and Li, G. (2017). Anti-Tumor Activity of Entrectinib, a Pan-TRK, ROS1 and ALK Inhibitor, in\r, ETV6-NTRK3\r, -Positive Acute Myeloid Leukemia. Mol Cancer Ther 17(2):455-463.
2. 罗氏诊断产品 (上海) 有限公司生命科学部. Kapa RNA HyperPrep with Riboerase试剂盒产品说明书.