KAPA建库试剂盒在通用方法学中的应用 下一代测序技术(NGS)，又称为大规模平行测序技术，通常指第二代和第三代测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在各个领域得以迅速应用。
按所测序核酸分子的类型不同，NGS文库类型可分为DNA 文库—全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES)，染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq)；RNA 文库—转录组测序, RNA免疫沉淀测序 (RIP-seq)。KAPA NGS系列产品可覆盖所有类型文库构建应用。
转录组测序 (RNA-Seq) 是目前应用最为广泛的一种测序方法之一，是转录组研究的重要方法。转录组测序可以提供整个转录本的信息，可以研究基因的差异表达，确定基因或转录本结构，检测转录本的结构变异，识别可变剪切，发现非编码RNA (non-coding RNA) 等。而KAPA rRNA去除试剂盒加是使用一种针对性的酶降解法来移除核糖体RNA (rRNA) 从而对总RNA进行纯化，这样做的优势是可以得到不带polyA尾的RNA，包括非编码RNA和前体RNA，为后续的研究提供更多的分析选择性。该试剂盒是链特异性建库，普通的转录组测序文库是无法保留转录本的方向信息的，不知道序列是自于基因本身还是它的反向互补序列，而很多基因区域都存在着正反义链的转录本，尤其是大多数非编码RNA都来自反义链。本文中用KAPA rRNA去除试剂盒与KAPA RNA stranded试剂盒对小鼠小脑、皮质、嗅球的转录组进行了分析。以研究小鼠各个脑组织中的RNA表达与甲基化的关系。
实验背景
以往的研究发现成年小鼠各组织中脑的5hmC水平显著高于其他组织。根据以往的研究发现，从胚胎到成年期小鼠脑内的5hmC水平一直较高。为了进一步了解5hmC在脑发育中的重要性。因此通过对小鼠脑中几个组织：小脑、嗅球以及皮质的甲基化水平进行初步分析。在以往的研究中也了解到，甲基化及羟甲基化的高低与转录组有重要联系。为了进一步证明，该实验也对小鼠各个组织中的RNA表达进行了分析。进一步将前期的甲基化结果与其关联，验证小鼠脑中各种RNA表达与甲基化的关系。
生物材料：雌性c57小鼠小脑、皮质、嗅球
实验目的
去除总RNA中rRNA后构建小鼠脑组织RNA文库，分析小鼠脑发育相关基因的表达及其中非编码RNA的作用。
关键词：rRNA去除，链特异性建库，小鼠，脑组织
实验步骤
一.RNA分离
- RNA 提取并测定浓度
Trizol法提取总RNA后，用RNA纯化浓缩试剂盒进行纯化。纯化后各样品的浓度为：小鼠小脑：971.5 ng/μl；小鼠嗅球：297.7 ng/μl；小鼠皮质；1715.2 ng/μl。 - 取1 μg进行后续反应
根据Qubit的定量，取约 1 μg的全RNA，溶于10 μl无核酶水中 (小鼠小脑：取1 μl；小鼠嗅球：取3.36 μl；小鼠皮质；取0.59 μl)。
二、核糖体去除 (大概需要 1 h)
Oligo杂交及rRNA去除
注： 1)主要用于总量为100 ng－1μg的总RNA，溶于10 μl无核酸酶水中：2)杂交体系和rRNA去除体系需在实验前事先准备好，并在室温条件下备用；3)由于PCR程序时需要中断并加入后续试剂，需要提前制备好下一步试剂，并在中断时加入。
- 根据下表先设置好PCR仪的相关程序。PCR程序中涉及逐步降温，应提前设置好并保存备用。
- 按照下表体系，在PCR管中配置rRNA杂交体系 (体系25 μl，热盖100 °C)
- 将准备好的样品管放入PCR仪并开始第1步设置的PCR程序。
- 95 °C 2 min结束后，在PCR程序进行到降温前，将RNase H加入体系，待温度降至45 °C暂停时，将事先配制好的5 μl的去除杂交体系加入PCR管中，开始后续程序，至结束。
rRNA去除纯化
- 准备2.2×磁珠进行纯化，按照下表体系进行配置
- 将体系转入1.5 ml离心管，枪头吹打混匀。室温下孵育5 min，以保证磁珠和RNA充分结合。
- 将离心管放置在磁力架上，室温静止5 min，待磁珠吸附在磁力架上，液体澄清后，小心吸取75 μl上清并弃液。
- 继续将离心管放在磁力架上，加入200 μl的80%乙醇。
注：垂直加入液体，尽量不要将磁珠吹下管壁。
- 保持离心管不动大于30 s，同时按逆时针或顺时针方向旋转EP管，对磁珠进行清洗后，小心吸弃上清。
- 继续将离心管放在磁力架上，加入200 μl的80%乙醇。
- 保持离心管不动大于30 s，同时按逆时针或顺时针方向旋转EP管，对磁珠进行清洗。
- 在室温开盖晾干磁珠约3-5 min，注意及时查看磁珠的状态，直到乙醇蒸发完毕。
DNase消化
为了将杂交体系中的寡核苷酸以及去除的rRNA清除干净，需要用DNase进行后续处理，参照试剂盒标准配置DNase消化体系。
- 按下表配制消化反应体系：
- 枪头吹打混匀，掌上离心机轻微离心后，室温放置3 min以保证RNA可以充分从磁珠上被洗脱下来。
- 将管子放于磁力架5 min左右，直到磁珠被吸附在磁力架上，即液体澄清后，从管中吸取20 μl液体到新的PCR管中，弃去带有磁珠的管。
- 按照下述PCR体系进行反应 (体系：2 μl，热盖42 °C)。
- 完成后立即进行纯化。
DNase消化后纯化
- 利用2.2×磁珠进行纯化，纯化体系如下表所示，同时将样品转入1.5 ml离心管内：
- 枪头吹打混匀磁珠，轻甩离心后，室温孵育5 min保证RNA和磁珠充分混合。
- 将管子放于磁力架5 min左右，直到磁珠被吸附在磁力架上，且液体澄清。加入200 μl的80%乙醇清洗，竖直加入乙醇，防止将磁珠吹下。
- 管子依旧在磁力架上，此时将管子顺时针或逆时针旋转2圈后。吸弃乙醇，可残留少部分。
- 继续加入200 μl的80%乙醇清洗，竖直加入乙醇，防止将磁珠吹下。
- 管子依旧在磁力架上，此时将管子顺时针或逆时针旋转2圈。
- 吸弃乙醇，需充分吸干,可以黄枪头套用白枪头进一步吸取。
- 室温下晾干磁珠3-5 min，注意及时查看磁珠的状态，直到乙醇蒸发干净。
- 取11 μl无核酸酶水溶解RNA。
- 取1 μl用于浓度测定，10 μl用于后续建库或其他实验。
三、RNA文库构建 (约需4.5 h)
RNA片段化
注：
1) 此阶段实验样本为RNA，需处于无RNA酶环境内操作，所用仪器，耗材及试剂均需以无核酸酶水配置或经过无核酸酶处理。
2) 需准备冰板，反应体系等样品尽量保持在冰上。
- 在PCR管内参照下表准备Fragment, Prime Buffer (1×)
- 吹打混匀样品，保持管在冰板上。
- PCR 仪中 85 ℃孵育6 min (体系20 μl ，热盖100 °C)。
注：本次实验中将RNA打断成400 bp片段，选用以上的反应条件，如目标片段为其他大小，请根据说明书选择其他条件。
- 完成后转入冰上，立马进行下一步反应。
一、二链合成
注：
1)按说明书操作进行，注意在PCR仪中进行PCR操作时，注意设置热盖 (75 °C)。
2)此阶段实验样本为RNA，需处于无RNA酶环境内操作，所用仪器，耗材及试剂均需以无核酶水配置或经过无核酶处理。
3)样品均需在冰上处理，保证低温环境，将样品放在冰板上进行试验操作。
cDNA纯化
注：
1) 此阶段实验样本为cDNA 。
2) 磁珠需要提前半小时拿出，室温下放置再使用。
3) 按照说明书进行实验操作。
4) 反应结束后可立即进行下一步，或选择暂停实验，并将样品用15 μl 1xA尾buffer重悬存于4 °C不超过24 h，不能冷冻。
加A尾
注：样品均需在冰上处理，保证低温环境，将样品放在冰板上进行试验操作。
- 根据说明书配制反应体系，
注：如未直接从上一步开始进行试验，选用的反应体系稍有不同。 - 将上述体系和磁珠结合，吹打混匀后转入PCR管内。
- PCR仪中设置下列反应程序 (反应体系: 30 μl，热盖60 °C)。
接头连接
- 根据说明书配制反应体系，在我们的实验中，起始量为50-200 ng，因此接头使用50 nM。
- 吹打混匀，PCR仪内20 °C 15 min（体系70 μl，热盖30 °C)。
磁珠纯化（两次）
注：
1) 配制磁珠反应体系时。吹打保证样品充分混匀。
2) 加入 80%乙醇清洗磁珠时，管子应紧贴磁力架再进行旋转; 按顺时针或逆时针旋转两次。
3) 吸弃乙醇时尽量不碰到磁珠，晾干3-5 min，注意磁珠不能太干. 晾干时请注意磁珠状态，对光看时应无反光，也没有干裂为合适的晾干程度。
4) 每次洗涤结束后，加入50 μl无核酸酶水。室温放置2 min将DNA溶解，此操作后，实验可以暂停，并将样品存于4°C，但不超过24小时。
文库扩增
依照说明书进行。
磁珠纯化文库 (一次)
注：
1) 可按照说明书进行，注意事项同“两次磁珠纯化”。
2) 在我们的实验中，洗涤晾干后的磁珠 加入22 μl 无核酸酶水溶解，室温放置2 min，以充分将DNA溶解。而后将管放于磁力架5 min后，待磁珠吸附稳定后。 吸出20 μl样品到新的PCR管中。文库纯化好以后可存于4 °C不超过1周，或在-20 °C条件下不大于一个月。
实验结果
rRNA 去除
符合预期效果，去除量近90%。去除后测定的RNA浓度为：小脑：13.9 ng/μl；嗅球：13.4 ng/μl；皮质：108.4 ng/μl。
文库构建
根据试剂盒要求，50-200 ng起始量用8-12 Cycle，我们选用了10个cycle， 扩增后测浓度，总量约为250 ng。送测序公司库检合格，正常上机测序。
用户使用心得
试剂盒使用总体简单易操作，rRNA去除效果比较好，因rRNA去除后浓度比较低，建议用Qubit测定。PCR热盖温度应选用低温，以免影响酶及磁珠。