稻瘟病菌分生孢子非靶定量脂质组的样品制备与检测方法
Sample Preparation and Detection Methods for Nontargeted Quantitative Lipidomics with Magnaporthe oryzae Conidia   

材料与试剂

1. 直径为9 cm的培养皿
2. 50 mL离心管（339652，Thermo Scientific^TM）
3. 滤布（Miracloth；Millipore, catalog number: 475855-1R）
4. 涂布棒（Disposable Cell Spreaders, catalog number: 65-1010，STERILE）
5. 血球计数板（1103，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）
6. 标准级显微镜盖玻片（10212222C，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）
7. 稻瘟病菌菌株（野生型菌株B157由新加坡淡马锡生命科学研究院Naweed I. Naqvi实验室惠赠）
8. 疏水玻片（Microscope Cover Glass；fisherbrand, catalog number: 12541005）
9. 内标物质包括：5 μg/mL的硬脂酸-d₃₅（货号C117066，记作FA 18:0-d₃₅）购自C/D/N Isotopes Inc（Pointe-Claire，Quebec，Canada）；2 μg/mL的LPC 18:1-d₇（1-油酰基(d₇)-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；货号791643C）、2 μg/mL的LPE 18:1-d₇（1-油酰基(d₇)-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；货号791644C）、5 μg/mL的PC 15:0-18:1-d₇（1-十五烷酰基-2-油酰基(d₇)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；货号791637C）、5 μg/mL的PE 15:0-18:1-d₇（1-十五烷酰基-2-油酰基(d₇)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；货号791638C）、5 μg/mL的PG 15:0-18:1-d₇（1-十五烷酰基-2-油酰基(d7)-sn-甘油-3-磷酸甘油；货号791640C）、2 μg/mL的SM d18:1-18:1-d₉（N-油酰基(d9)-D-赤型鞘氨酰基磷酰胆碱；货号 791649C）和5 μg/mL的TAG 15:0-18:1-d₇-15:0（1,3-双十五烷酰基-2-油酰基(d7)-甘油；货号791648C）购于Avanti Polar Lipids（Alabaster，Alabama，USA），所有内标物质的溶剂均为二氯甲烷/甲醇（1:1，v:v）混合液
10. 甲醇（Methanol，MeOH；天津市百世化工有限公司）
11. 甲基叔丁基醚（Methyl tert-butyl ether，MTBE；天津市永大化学试剂有限公司）
12. 二氯甲烷（Merck，货号：75-09-2）
13. 甲酸铵（Merck，货号：540-69-2）
14. 甲酸（Formic acid；天津市科密欧化学试剂有限公司）
15. 异丙醇（Isopropyl alcohol，IPA；天津市富宇精细化工有限公司）
16. 乙腈（Acetonitrile；天津市永大化学试剂有限公司）
17. Prune-agar（PA）固体培养基配方（1 L）(见溶液配方)
18. 10 mmol/L甲酸铵溶液（1 L）(见溶液配方)
19. 0.1%甲酸水溶液（1 L）(见溶液配方)
20. 75%酒精溶液（1 L）(见溶液配方)
    

仪器设备

1. GR60DA立式高压灭菌锅（ZEALWAY）
2. 超净工作台（ESCO，ACB-4A1）
3. 人工气候箱（宁波莱福科技有限公司）
4. 冷冻高速离心机（Sorvall Legend Micro 17R，Thermo Fisher）
5. 翻转式实验室摇床（ROCKER 2D，IKA）
6. 样品冷冻研磨仪器（LUKYM-I，广州露卡测序仪器有限公司）
7. 通风柜（FUME HOOD，上海正申实验室设备有限公司）
8. 氮吹仪（NDK200-2N，杭州米欧仪器有限公司，MIULAB）
9. 超高效液相色谱-高分辨串联质谱联用仪：赛默飞世尔公司Ultimate 3000超高效液相色谱仪（UHPLC）和Q Exative四极杆-静电场轨道阱质谱仪（简写QE）
   

实验步骤

一、样品准备

将新鲜的稻瘟病菌接种到PA培养基上（图1），25 ℃恒温人工气候箱先黑暗培养3天，再黑暗光照交替（12 h:12 h；光源使用的是LED灯管，220 V电压，H1%额定光照度）培养7天后收集分生孢子，用血球计数板定量分生孢子浓度为3.0 × 10⁵个/毫升，定容30 mL，四个生物学重复。


图1. 在PA培养基上生长不同天数的稻瘟病菌菌落形态

二、总脂提取
参照Vitali Matyash等（2008年）的方法（Matyash et al., 2008）。

1. 萌发初始阶段分生孢子脂质的提取
   1. 取浓度为3 × 10⁵个/毫升的孢子悬浮液30 mL于50 mL试管中；
   2. 在2,000× g条件下，室温离心10 min；
   3. 弃液体，加入1.5 mL甲醇悬浮；
   4. 向悬浮液中加入5 mL甲基叔丁基醚；
   5. 涡旋振荡1 min；
   6. 摇床室温孵育2 h；
   7. 加入1.25 mL无菌水；
   8. 在2,000× g条件下，室温离心15 min；
   9. 静置待分层；
   10. 取上相液体，用氮吹仪吹干后即得总脂（用氮吹仪吹氮时，需控制氮气缓慢流出，且出气口在距离管口约0.5 cm处进行氮吹，待液体余1.5–2.0 mL时，迅速将其转移至2 mL离心管中，氮吹仪吹干直至吹满整管氮气时，立即盖上管盖）；
   11. 于-80 ℃保存；
   12. 选做。取10）中下层液用2 mL溶剂混合物（甲醇：甲基叔丁基醚：水=3:10:2.5，v/v/v）重新提取，步骤同上，取上相液体，和10）中的混合；
   13. 提取的脂质也可以溶解于200 μL氯仿：甲醇：水（60:30:4.5，v/v/v）中储存。
       
2. 萌发6 h分生孢子脂质的提取
   1. 取浓度为3 × 10⁵个/毫升的孢子悬浮液30 mL于疏水玻片上（300片）萌发6 h；
   2. 弃去萌发液，将玻片冷冻干燥后液氮研磨或样品冷冻研磨仪上进行研磨；
   3. 每100片研磨后快速放入50 mL离心管中；
   4. 加入4.5 mL甲醇和15 mL甲基叔丁基醚；
   5. 涡旋振荡1 min；
   6. 摇床室温孵育2 h；
   7. 加入3.75 mL无菌水；
   8. 在4,000× g条件下，室温离心15 min；
   9. 静置待分层；
   10. 取来源于300片研磨样品的上相液体混合在一起，用氮吹仪吹干后即得总脂（用氮吹仪吹氮时，需控制氮气缓慢流出，且出气口在距离管口约0.5 cm处进行氮吹。待液体余1.5–2.0 mL时，迅速将其转移至2 mL离心管中，氮吹仪吹干样品，并使样品管充满氮气，立即盖上管盖）；
   11. 样品于-80 ℃保存；
   12. 选做。取10）中下层液用适当体积的溶剂混合物（甲醇：甲基叔丁基醚：水=3:10:2.5，v/v/v）重新提取，步骤同上，取上相液体，和10）中的混合；
   13. 提取的脂质也可以溶解于200 μL氯仿：甲醇：水（60:30:4.5，v/v/v）中储存。

三、样品前处理

取总脂样本，加1 mL MTBE，混合均匀，在15,000× g和4 ℃条件下离心10 min；取800 µL上清液，加20 μL内标于温和氮气下干燥；干燥物复溶于100 μL二氯甲烷/甲醇（1:1，v/v），得上机测试样本。从所有制备好的样本中取等体积样本混合，得质控样本。

四、液相色谱-高分辨质谱检测分析

采用赛默飞世尔公司Ultimate 3000系列超高效液相色谱系统和沃特世公司CSH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）对样本进行色谱分离。正离子模式流动相组成为（A）10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸水溶液和（B）含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的异丙醇/乙腈（9:1，体积比）。采用线性梯度模式进行洗脱分离，梯度如下：0 min，40% B；2 min，45% B；4 min，55% B；10 min，55% B；14 min，90% B；15 min，95% B；18 min，95% B；18.1 min，40% B并维持至20 min。负离子模式流动相组成为（A）10 mmol/L甲酸铵水溶液和（B）含10 mmol/L甲酸铵的异丙醇/乙腈（9:1, 体积比）。采用线性梯度模式进行洗脱分离，梯度如下：0 min，40% B；2 min，45% B；4 min，55% B；10 min，55% B；14 min，90% B；15 min，95% B；18 min，95% B；18.1 min，40% B并维持到20 min。流速均为0.3 mL/min，进样量为2 μL。
赛默飞世尔公司Q Exactive四极杆-静电场轨道阱质谱仪（QE）用于质谱分析。采用加热电喷雾离子源（HESI）对代谢物进行正离子模式（HESI+）和负离子模式（HESI-）离子化。离子源主要参数设置如下：喷雾电压为3.5 kV，毛细管温度和辅助气温度均为350 ℃。鞘气流速为正离子模式40（任意单位），辅助气流速为10（任意单位）。S-Lens RF设为50（任意单位）。一级质谱扫描范围为质荷比130–1950，分辨率为70000（质荷比200），AGC阈值1 × 10⁶。同时，采用数据依赖识别（DDA）模式对每个扫描循环的最多10个母离子的二级质谱碎片信息进行采集，HCD碰撞能量设为20、30和40 eV，二级质谱分辨率为17500，AGC阈值为5 × 10⁵。

五、原始质谱数据预处理

液相色谱-高分辨质谱：典型的基峰离子（BPI）色谱图如图2所示。先用ProteoWizard软件将原始质谱数据转化为mzXML格式，然后在R软件平台下采用XCMS和CAMERA软件包处理数据。对于XCMS软件包，主要参数设置为：挑峰参数（method = centWave, ppm = 5, peakwidth = c (5,50), snthresh = 10），峰对齐参数（第1和2次bw分别为6和3），保留时间校正方式为obiwarp。对于CAMERA软件包，采用默认参数对同位素峰、加合离子峰和碎片进行注释分析。最终输出为一个峰表文件，包含观察量（样本名）、变量（保留时间_质荷比）和峰面积。在进行单维和多维统计分析前，采用稳定性同位素内标和样本量对峰面积数据进行校正。


图2. 不同离子模式下基峰离子（BPI）色谱图. 注：（A）为B157菌株的孢子在培养时间为0 h（B157-0 h）和6h（B157-6 h）获得的脂质样品和质控样品在正离子模式基峰离子色谱图；（B）为B157菌株的孢子在培养时间为0 h（B157-0 h）和6h（B157-6 h）获得的脂质样品和质控样品在负离子模式基峰离子色谱图

六、统计分析和差异性代谢物筛选

对于多维统计分析，将归一化数据进行多维统计分析如主成分分析（PCA）、偏最小二乘方-判别分析（PLS-DA）和正交过滤偏最小二乘方-判别分析（OPLS-DA）。在分析前首先对数据进行默认的平均中心化（mean-centered）和par格式化处理。模型质量评价参数为R²X或R²Y和Q2值，用于评价模式识别模型的鲁棒性，其中R²X（PCA）或R²Y（PLS-DA）表示当前模型可对数据方差进行解释的比例，即解释率，表明模型拟合优度（the goodness of fit）。Q2表示当前模型可对数据方差进行预测的比例，即预测率，表明当前模型的预测能力。
p值，计算自R平台，当变量数据呈正态分布时p值来自于Welch’s t test（参数检验）结果，当变量数据呈非正态分布时p值来自于Wilcoxon Mann-Whitney test（非参数检验）结果。
根据火山图（Volcano plot）分析筛选差异代谢物，筛选标准采用单维统计分析的p值（小于0.05，即-log10p大于1.30）与倍数变化FC（fold change大于1.2倍，即log₂FC绝对值大于0.26）相结合的方法筛选差异性代谢物。倍数变化（Log₂FC）计算方法为组1和组2两组数据均值之比的对数（以2为底），正值表示该物质在组1中的水平高于组2，负值则相反。

七、脂质结构鉴定

采用LipidMatch软件（Koelmel et al., 2017）对脂质进行结构鉴定，软件版本为3.0.0，主要参数如下：RT Window（for matching peaks to MS/MS scans）为0.14，MZ Search Tolerance MS1为0.005 Da，MZ Search Window MS2为10 ppm；Intensity Threshold MS2为1000。

结果与分析

根据变量的火山图（Volcano plot）来寻找差异性代谢物，如图3和4。采用倍数变化（阈值：1.2倍）结合单维统计的p值（阈值<0.05）寻找差异代谢物。整合正负离子两种模式的差异代谢物，最终筛选检测到170种含量变化的脂质，其中99种脂质下降，71种脂质上升。部分差异性代谢物如图5和表1所示。


图3. B157-0 h和B157-6 h组样本正离子模式火山（Volcano plot）图


图4. B157-0 h和B157-6 h组样本负离子模式火山（Volcano plot）图


图5. 部分含量有变化的脂质类型. 注：A为PC（磷脂酰胆碱）；B为PE（磷脂酰乙醇胺）；C为PS (磷脂酰丝氨酸)；D为PEtOH（脂质醇）；A-D中横坐标上的每个数字串代表脂质的种类。

表1. 部分含量有变化的脂质类型详细数据

失败经验

脂质暴露在空气中会发生氧化反应，因此，脂质在氮吹仪下吹干后，一定要在氮气流下快速盖上离心管盖，避免与空气直接接触，并用封口膜将离心管口紧密封住，并于-80 ℃保存。

溶液配方

1. Prune-agar（PA）固体培养基配方（1 L）
   西梅果汁（Prune juice）40 mL，乳糖（Lactose）2.5 g，蔗糖（Sucrose）2.5 g，酵母提取物（Yeast extract）1 g，琼脂粉（Agar）15 g，加去离子水定容到1 L。然后用10 M NaOH调节pH至6.5，115 ℃高温高压灭菌30 min。
2. 10 mmol/L甲酸铵溶液（1 L）
   称取0.6306 g甲酸铵固体溶于超纯水中，并定容到1 L。
3. 0.1%甲酸水溶液（1 L）
   取1 mL甲酸溶液于超纯水中，并定容到1 L。
4. 75%酒精溶液（1 L）
   取750 mL无水乙醇溶于去离子水中，并定容到1 L
   

致谢

感谢国家自然科学基金（32022070；31970139）的支持。本课题组在最近发表的文章中使用了文中的脂质检测方法（Liu et al., 2024a and Liu et al., 2024b）。

参考文献

1. Koelmel, J. P., Kroeger, N. M., Ulmer, C. Z., Bowden, J. A., Patterson, R. E., Cochran, J. A., Beecher, C. W. W., Garrett, T. J. and Yost, R. A. (2017). LipidMatch: an automated workflow for rule-based lipid identification using untargeted high-resolution tandem mass spectrometry data. BMC Bioinformatics 18(1): 331. https://doi.org/10.1186/s12859-017-1744-3
2. Liu, Q., Long, R., Lin, C., Bi, X., Liang, Z. and Deng, Y. Z. (2024a). Phosphatidylethanolamines link ferroptosis and autophagy during appressorium formation of rice blast fungus. Mol Plant Pathol. 25(7): e13489. https://doi.org/10.1111/mpp.13489
3. Liu, Q., Long, R., Zhi, C., Liang, Z. and Deng, Y. Z. (2024b). PUFA-PLs biosynthesis enzymes contribute to pathogenic development of rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Mycology. 15(4): 602–619. https://doi.org/10.1080/21501203.2024.2350169
4. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A. and Schwudke, D. (2008). Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49(5): 1137–1146. https://doi.org/10.1194/jlr.d700041-jlr200