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小鼠粪便样本中短链脂肪酸的定量检测
Quantitative Analysis of Short-chain Fatty Acids (SCFAs) in Mouse Fecal Sample   

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摘要:短链脂肪酸 (Short-chain fatty acids, SCFAs) 是肠道菌群的重要代谢产物,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,对宿主的许多生理代谢过程具有有益的调节作用。由于以往检测方法存在操作耗时长、所需样本量大、机器批次效应偏差、前处理误差大的缺点,无法对样本中的SCFAs进行准确定量。本文通过添加内标脂肪酸的方法,可以在1.5小时内完成粪便样本的前处理手动操作,并且只需0.03 g的粪便样本,完成对十种SCFAs的定量检测。本方法可拓展至其他生物样品类型 (器官组织、微生物培养液等),为肠道菌群代谢相关研究提供技术参考。

关键词: 短链脂肪酸, 气相色谱-质谱技术, 肠道菌群

材料与试剂

材料:

  1. 0.6 ml离心管
  2. 气相色谱-质谱上样瓶 (Agilent, catalog number: 5181-0714)
  3. 内插管 (Agilent, catalog number: 5181-1270)
  4. 氧化锆珠子 (Biospec, catalog number: 11079110z)
试剂:
  1. SCFAs混合酸标准品 (Sigma, catalog number: CRM46975)
  2. 6,6,6-d3己酸 (cdn isotopes, catalog number: ND-3993)
  3. 无水乙醚 (上海凌峰)
  4. 无水Na2SO4 (Sigma, catalog number: 238597)
  5. 盐酸 (上海凌峰)
  6. N, O-三甲硅烷基三氟乙酰胺 (BSTFA, Sigma, catalog number: 25561-30-2)

仪器设备

  1. 涡旋振荡器 (赛默飞,Vortex-Genie 2)
  2. 低温离心机 (艾本德,5427R)
  3. 通风橱
  4. 8890-7000D GC-MS
  5. HP-5 ms色谱柱

实验步骤

一、前期准备工作
       按照终浓度配置以下溶液:

  1. 5 M盐酸
  2. 10 µg/ml 6,6,6-d3己酸内标溶液 (Cai,2017)
  3. 含有10 µg/ml内标的不同梯度浓度SCFAs标准品溶液 (25、50、100、200、400、800 μM)

二、样品前处理
  1. 取30 mg左右冻存的小鼠粪便于1.5 ml离心管内,加入350 µl内标溶液和10 mg左右氧化锆研磨珠。
  2. 将离心管水平固定在振荡器圆盘上,4 °C环境中10档高速震荡2 min左右进行匀质,直至形成匀浆状态。
  3. 将振荡器放置于4 °C环境中,3档低速震荡30 min。
  4. 4 °C环境中,13,000 x g离心30 min。
  5. 取100 µl上清至0.6 ml离心管,加入10 µl 5 M盐酸,震荡混匀进行酸化;另取100 µl上清至0.6 ml离心管,标记并于-80 °C冻存备份。
  6. 加入100 µl无水乙醚,充分震荡混匀,放置冰上5 min (Zhang,2019)。
  7. 4 °C环境中,10,000 x g离心5 min。
  8. 取上层 (乙醚层) 至含有10 mg左右无水Na2SO4的0.6 ml离心管中。
  9. 再次加入100 µl无水乙醚至剩余溶液中进行第二次和第三次抽提 (重复6-8步2次),将三次抽提的乙醚层抽提溶液混匀震荡,4 °C环境中10,000 x g离心3 min。
  10. 取160 µl离心后的上层乙醚抽提混合液至内插管中,加入8 µl BSTFA震荡混匀。
  11. 室温静置超过8 h后,上机检测。检测仪器进样、升温等参数见表1,SIM模式下进行靶标脂肪酸的定性和定量检测见表2。

    表1. GC-MS上机检测参数设定


    表2. SIM模式下SCFA保留时间和定性定量离子

结果与分析

下图展示了SIM模式下800 μM SCFAs标准品溶液和小鼠粪便样品的检测色谱图 (图1)。


图1. SCFAs标准品和小鼠粪便样品在SIM检测模式下的色谱图

致谢

本文得到青年千人人才计划资助。

参考文献

  1. Cai, J., Zhang, J., Tian, Y., Zhang, L., Hatzakis, E., Krausz, K. W., Smith, P. B., Gonzalez, F. J. and Patterson, A. D. (2017). Orthogonal Comparison of GC-MS and (1)H NMR Spectroscopy for Short Chain Fatty Acid Quantitation. Anal Chem 89(15): 7900-7906.
  2. Zhang, S., Wang, H. and Zhu, M. J. (2019). A sensitive GC/MS detection method for analyzing microbial metabolites short chain fatty acids in fecal and serum samples. Talanta 196: 249-254.
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Copyright: © 2020 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘红宾, 汤锦辉, 戴磊. (2020). 小鼠粪便样本中短链脂肪酸的定量检测. Bio-101: e2003367. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003367.
How to cite: Liu, H. B., Tang, J. H. and Dai, L. (2020). Quantitative Analysis of Short-chain Fatty Acids (SCFAs) in Mouse Fecal Sample. Bio-101: e2003367. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003367.
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lichen bu
我想问一下“取30 mg左右冻存的小鼠粪便于1.5 ml离心管内,加入350 µl内标溶液和10 mg左右氧化锆研磨珠。”这一步您只加内标,不加超纯水吗?如果加标准品,您一般加多少ul?
2021/3/5 11:20:44 回复
红宾 刘
China agricultural university

你好,内标溶液在前期准备工作中已经制备好,用超纯水溶至终浓度为10ug/ml。这一步是不加其他SCFA标准品的,只需要加内标溶液。

2021/3/7 5:24:30 回复


lichen bu

谢谢,那如果您做标准曲线的话,大概加多少ul?操作步骤都是一样的吗?只是把小鼠粪便换成了标准品?

2021/3/9 12:52:59 回复


红宾 刘
China agricultural university

你好,标准曲线是用含有相同浓度内标的不同浓度梯度的标准品做检测建立,和粪便样品操作步骤相一致,你只需要把标准品等同于含有内标的粪便提取上清,进行相同后续处理即可。

2021/3/9 19:41:33 回复


lichen bu

老师您好,我尝试了您的方法,其他都还可以,就是乙酸的峰和溶剂峰(BSTFA)混在一起了。而且BSTFA峰面积太高了,但掐掉前面又怕乙酸峰也没了。可能柱子不同,出峰时间不太一样

2021/4/10 22:25:40 回复


红宾 刘
China agricultural university

你好,升温程序是否调到一致?是否用的SIM模式?我之前没有遇到你说的情况,可以尝试在SIM模式下,降低升温速率

2021/4/12 3:10:18 回复


lichen bu

一致的,好谢谢的,我尝试一下sim模式,一直用的scan全扫描。

2021/4/14 15:28:45 回复