小鼠粪便样本中短链脂肪酸的定量检测
Quantitative Analysis of Short-chain Fatty Acids (SCFAs) in Mouse Fecal Sample   

材料与试剂

材料：

1. 0.6 ml离心管
2. 气相色谱-质谱上样瓶 (Agilent, catalog number: 5181-0714)
3. 内插管 (Agilent, catalog number: 5181-1270)
4. 氧化锆珠子 (Biospec, catalog number: 11079110z)

1. SCFAs混合酸标准品 (Sigma, catalog number: CRM46975)
2. 6,6,6-d3己酸 (cdn isotopes, catalog number: ND-3993)
3. 无水乙醚 (上海凌峰)
4. 无水Na₂SO₄ (Sigma, catalog number: 238597)
5. 盐酸 (上海凌峰)
6. N, O-三甲硅烷基三氟乙酰胺 (BSTFA, Sigma, catalog number: 25561-30-2)

仪器设备

1. 涡旋振荡器 (赛默飞，Vortex-Genie 2)
2. 低温离心机 (艾本德，5427R)
3. 通风橱
4. 8890-7000D GC-MS
5. HP-5 ms色谱柱
   

实验步骤

一、前期准备工作
       按照终浓度配置以下溶液：

1. 5 M盐酸
2. 10 µg/ml 6,6,6-d3己酸内标溶液 (Cai等，2017)
3. 含有10 µg/ml内标的不同梯度浓度SCFAs标准品溶液 (25、50、100、200、400、800 μM)

1. 取30 mg左右冻存的小鼠粪便于1.5 ml离心管内，加入350 µl内标溶液和10 mg左右氧化锆研磨珠。
2. 将离心管水平固定在振荡器圆盘上，4 °C环境中10档高速震荡2 min左右进行匀质，直至形成匀浆状态。
3. 将振荡器放置于4 °C环境中，3档低速震荡30 min。
4. 4 °C环境中，13,000 x g离心30 min。
5. 取100 µl上清至0.6 ml离心管，加入10 µl 5 M盐酸，震荡混匀进行酸化；另取100 µl上清至0.6 ml离心管，标记并于-80 °C冻存备份。
6. 加入100 µl无水乙醚，充分震荡混匀，放置冰上5 min (Zhang等，2019)。
7. 4 °C环境中，10,000 x g离心5 min。
8. 取上层 (乙醚层) 至含有10 mg左右无水Na₂SO₄的0.6 ml离心管中。
9. 再次加入100 µl无水乙醚至剩余溶液中进行第二次和第三次抽提 (重复6-8步2次)，将三次抽提的乙醚层抽提溶液混匀震荡，4 °C环境中10,000 x g离心3 min。
10. 取160 µl离心后的上层乙醚抽提混合液至内插管中，加入8 µl BSTFA震荡混匀。
11. 室温静置超过8 h后，上机检测。检测仪器进样、升温等参数见表1，SIM模式下进行靶标脂肪酸的定性和定量检测见表2。
    
    表1. GC-MS上机检测参数设定
    
    
    表2. SIM模式下SCFA保留时间和定性定量离子
    
    

结果与分析

下图展示了SIM模式下800 μM SCFAs标准品溶液和小鼠粪便样品的检测色谱图 (图1)。

图1. SCFAs标准品和小鼠粪便样品在SIM检测模式下的色谱图

致谢

本文得到青年千人人才计划资助。

参考文献

1. Cai, J., Zhang, J., Tian, Y., Zhang, L., Hatzakis, E., Krausz, K. W., Smith, P. B., Gonzalez, F. J. and Patterson, A. D. (2017). Orthogonal Comparison of GC-MS and (1)H NMR Spectroscopy for Short Chain Fatty Acid Quantitation. Anal Chem 89(15): 7900-7906.
2. Zhang, S., Wang, H. and Zhu, M. J. (2019). A sensitive GC/MS detection method for analyzing microbial metabolites short chain fatty acids in fecal and serum samples. Talanta 196: 249-254.