小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测
Quantitative Analysis of 16S rRNA Gene Copies in Mouse Fecal Sample   

材料与试剂

试剂：

1. 高保真酶 (PrimeSTAR, TAKARA, catalog number: R045A)
2. TB Green酶 (TAKARA, catalog number: RR820A)
3. Omega胶回收试剂盒 (Omega, catalog number: D2500-01)
4. 琼脂糖
5. 引物
   (27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 1541R-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA; 331F-TCCTACGGGAGGCAGCAGT, 797R-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT) (Jian等，2016)
   

仪器设备

1. Nanodrop 2000
2. 电泳仪
3. 普通PCR仪 (Bio-read)
4. 荧光定量PCR仪 (Bio-read)
   

实验步骤

一、全长16S rRNA基因标准品制备

1. 全长16S rRNA基因扩增
   
   PCR扩增体系：
   
   
   PCR扩增程序 (30个循环)：
   
   
   
2. 全长16S rRNA基因扩增产物回收
   按照胶回收试剂盒说明书，对PCR扩增产物进行回收，并利用Nanodrop对其浓度进行测定。
3. 全长16S rRNA基因扩增产物拷贝数确定
   举例：Nanodrop测得胶回收的16S片段的浓度为182 ng/μl，由于1,500 bp的16S核酸的分子量为5.1 x 10⁵ ng/nmol (https://www.genscript.com/conversion.html)，所以标准品中含有3.57 x 10^-4 nmol分子，根据阿伏伽德罗常数计算1 μl标准品中含有2.14 x 10¹¹个拷贝。
4. 全长16S rRNA基因扩增产物梯度稀释
   将标准品做10倍系列稀释，使其形成10⁹-10⁴拷贝/μl。

1. 全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测
   
   Real-time PCR扩增体系：
   
   
   PCR扩增程序 (40个循环)：
   
   
   
2. 构建16S rRNA基因梯度拷贝数标准曲线
   以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数 (Ct) 为纵坐标得到标准曲线，为待测样品的定量提供了定量检测的参照标准。
   
   
   

对小鼠粪便DNA待测样品，按照“全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测”中的程序与条件，进行real-time PCR检测。依据建立的标准曲线，计算出待测样品中的16S rRNA基因拷贝数。

结果与分析

图1展示了溶解曲线、标准曲线和待测样品的检测结果，溶解曲线结果显示扩增片段的单一特异性，标准曲线的相关性表明该方法对于检测不同16S rRNA基因拷贝数的样本具有很好的线性关系。依据标准曲线方程，Ct值为8的小鼠粪便DNA样品中含有的16S rRNA基因拷贝数为10^ (-0.2819 x 8 + 10.682) = 2.67 × 10⁸个。


图1. RT-PCR方法检测粪便样本中微生物16S rRNA基因拷贝数熔解曲线 (A-B) 和标准曲线 (C)

致谢

本文得到青年千人人才计划资助。

参考文献

1.  Jian, C., Luukkonen, P., Yki-Jarvinen, H., Salonen, A. and Korpela, K. (2020). Quantitative PCR provides a simple and accessible method for quantitative microbiota profiling. PLoS One 15(1): e0227285.