摘要:本方法概述了河湖着生硅藻的样品采集、永久玻片制作、显微鉴定及其注意事项,为规范实验操作过程/提高后续相关数据分析的可比性提供依据。本实验以固定面积法采集河湖自然底质表面的着生硅藻样品,通过强酸溶解有机质的方法,去除有机杂物及硅藻细胞内含物,只留下硅藻细胞壁,并利用树胶制作成永久玻片,在显微镜下鉴定、计数,得到硅藻种类及密度数据,用于下游群落分析。
关键词: 着生硅藻, 样品采集, 永久玻片, 鉴定, 计数
材料与试剂
- 样品瓶
- 硬质牙刷
- (可选) 刀片
- 圆形塑料片 (直径约6 cm)
- 100 ml量筒
- 1,000 μl和100 μl移液器吸头
- 2 ml离心管
- pH试纸
- 载玻片和盖玻片
- 无尘布
- 浓硫酸溶液
- 浓硝酸溶液
- 稀盐酸
- 重铬酸甲饱和溶液
- 无水乙醇及95%乙醇溶液
- 蒸馏水
- Naphrax树胶
- 二甲苯
- 镜油
- 树胶溶液 (见溶液配方)
仪器设备
- 剪刀
- 10 ml玻璃试管及金属试管架
- 1,000 μl和100 μl移液器
- 平口镊子
- 水浴锅
- 通风橱
- 离心机
- (可选) 加热板
- 光学显微镜
实验步骤
一、样品采集
- 合适的基质:直径6~20 cm的鹅卵石为最佳选择,实际情况中,也可以选择其他尺寸的石块,或沉水植物及挺水植物的水下部分茎段。
- 样品的收集:首先轻轻冲洗基质,去除表面松散的附着物,使用固定面积的圆形塑料片 (直径约6 cm) 覆盖在基质上,使用硬质牙刷刷去塑料片覆盖以外的所有附着物;取另一牙刷 (或刀片) 刷取并收集塑料片覆盖下的附着物,装入样品瓶中;至少重复采集5份平行样进行混合,记录总体积,并立即加入甲醛固定剂固定保存,使其在样品中的最终浓度为4%。
- 通过采集整株沉水植物或挺水植物水下部分植物茎段,直接刷取或剪成合适长度放入样品瓶中,加入蒸馏水快速摇晃,记录采样面积并加入甲醛溶液固定保存。
二、永久玻片制作
- 测量固定硅藻样品的体积;
- 视各样品浓度,取1~2 ml于厚壁玻璃试管中,放置在金属试管架上;
- 将水浴锅设置为85~90 °C,放置于通风橱中;
- 将试管架置于上述水浴锅中,并加入与样品等体积的浓硫酸溶液,加热0.5 h;
- 沿试管壁加入1~3滴浓硝酸溶液 (此反应比较猛烈,会产生大量棕色气体);待反应减弱或无反应时,加入与样品等体积的浓硝酸溶液,连续热水浴8 h以上;
- 反应完毕并冷却后,缓慢从水浴锅中取出试管架,置于试验台上,用1,000 μl移液器吸去上清;
- 加入0.5~1 ml重铬酸甲饱和溶液,摇匀后静置12 h;
- 将上述混合液转移至2 ml离心管中,不足2 ml则需加入蒸馏水定容至2 ml;
- 将适用于2 ml离心管的离心机转速设置为737.5 × g,离心30 min,去上清,再次加入蒸馏水定容至2 ml并摇匀,同等条件下再次离心,重复4~5次 (朱蕙忠等,2000);
- 待所有样品上清均为透明,且pH值为7后,加入95%乙醇溶液,定容至步骤2中的原始样品体积;
- 取稀盐酸洗过、浸泡在无水乙醇中的盖玻片 (2 cm*2 cm),用无尘布擦干后置于水平桌面上备用;
- 将步骤10中的样品摇匀后,使用100 μl移液器迅速吸取中间层溶液40 μl,垂直滴在盖玻片正中间,样品自动均匀扩散至整个盖玻片表面,待乙醇完全挥发干燥,或放置中加热板上加热干燥;
- 取树胶溶液40 μl,缓慢滴在干净的载玻片中间,使用平口镊子将上述固定有样品的盖玻片反盖在树胶溶液上,树胶溶液均匀扩散,如有气泡,使用牙签把气泡挤出,或使用加热板加热后去除气泡。贴上包含样品信息的标签并置于通风处干燥2~3天。若有树胶溢出,可使用牙签或手术刀将溢出的教剥离掉,达到便于观察和美观的效果。至此,着生硅藻永久玻片制成,等待镜检 (BS EN 13946, 2014)。
三、样品鉴定
- 确定分类标准:根据数据使用的需求确定鉴定到种或属水平,采用与研究区域相关的植物区系命名系统或国家级的硅藻名录、图册等权威资料作为分类参考标准;
- 镜检:将制作好的着生硅藻永久玻片置于光学显微镜下,低倍镜下寻找目标硅藻,然后在高倍镜下 (1,000倍) 使用油镜进行鉴定和计数,带有相差或微分干涉功能的显微镜为佳;
- 计数:按行格法或视野法计数硅藻壳瓣数 (一个细胞为两个壳瓣),计数总数不低于400 (BS EN 14407, 2014),计数表格如表1所示;
表1. 着生硅藻定量检测记录表
- 质量控制:同一批样品中随机选取不低于10%的样品在同等条件下进行重复计数,两次结果的误差均在15%以内,则本次计数结果有效。
注意事项
- 加入浓硫酸和浓硝酸时应缓慢、沿试管壁加入,避免反应剧烈而溢出。
- 水浴锅长时间高温工作时,应有人值守,定时加水,避免烧干。
- 上清为酸液,需专门废液回收处理。
- 每次吸取上清酸液时应在不吸到沉淀物的前提下,多去上清,如果沉淀物被搅动,则需重新离心。
- 配制树胶-二甲苯溶液时,不可剧烈摇晃,避免气泡产生。
- 树胶彻底干燥、凝固后的永久玻片方可镜检。
失败经验
- 泥沙较多:当样品中泥沙较多时,会在镜检时难以观察。需在“二、永久玻片制作”步骤2中取样时,摇匀后待样品稍沉淀10 s左右,待泥沙较硅藻先沉降再取上层样品;步骤12中也可在摇匀后约10 s再取上层样品制作永久玻片,可有效减少泥沙的影响。
- 样品浓度低:若最终样品中硅藻细胞密度非常低,会影响数据准确性。需将“二、永久玻片制作”中步骤10所得样品进行离心,加入样品原始体积的1/5至1/2体积的95%酒精溶液,再进行玻片制作,一般不低于100 μl;一并记录该信息用于最后密度计算。
- 硅藻细胞破碎:若个体较大的硅藻细胞破碎率较高,难以准确计数。需调低“二、永久玻片制作”步骤9中的离心转速,并适当延长离心时间。
溶液配方
- 树胶溶液
Naphrax: 二甲苯 (v:v) = 1:1
配制之前将Naphrax树胶置于温水 (> 80 °C) 中加热,使其成为液态后取适量体积到2 ml离心管中,加入等体积二甲苯,轻轻上下颠倒使其充分溶解备用,切勿用力摇晃。
参考文献
- 朱蕙忠, 陈嘉佑. (2000) 中国西藏硅藻. 科学出版社.
- BS EN 13946. (2014). Water quality: Guidance for the routine sampling and preparation of benthic diatoms from rivers and lakes.
- BS EN 14407. (2014). Water quality: Guidance for the identification and enumeration of benthic diatom samples from rivers and lakes.
Copyright: © 2020 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:陈威, 宋高飞, 赵先富, 杨英, 张俊芳, 马沛明. (2020). 河湖着生硅藻样品采集、永久玻片制作及鉴定. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003564. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003564.
How to cite: Chen, W., Song, G. F., Zhao, X. F., Yang, Y., Zhang, J. F. and Ma, P. M. (2020). Sampling, Preparation and Identification of Benthic Diatom from Rivers and Lakes. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003564. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003564.