利用Parallel-Meta Suite在多平台下进行交互式微生物组分析
Interactive Microbiome Data Analysis on Multiple Platforms Using Parallel-Meta Suite   

仪器设备

目前Linux（如Ubuntu、CentOS、RedHat等）、Mac OS和Windows 10/11内置的WSL（Windows Subsystem for Linux）等操作系统均能够支持PMS。
PMS仅需要具有约2GB内存的标准计算机即可支持其安装与执行。为了更好的体验和更快的计算，我们推荐在具有8GB以上内存和4核3.3Ghz以上CPU的标准计算机上使用PMS。

软件

PMS软件最新版本为3.7。该软件主要由C++和R语言开发编写。
C++语言的支持需要安装C++编译器（例如g++）。对于Linux操作系统，大多版本已经在系统中安装了g++。对于Mac OS，建议从App Store安装Xcode应用程序，即可完成编译器的安装与配置。
R语言需要安装r-base提供运行环境。对于Linux操作系统，可以使用系统自带的包管理工具安装r-base。对于Mac OS，建议从App Store安装RStudio应用程序，即可完成R运行环境的安装与配置。
vsearch已经内置于PMS中，版本号为2.15.1。如果想要手动安装或更新，请从https://sourceforge.net/projects/vsearch/下载，并放置“vsearch”于$ParallelMETA/bin/ 目录下。

实验步骤

1. 安装Parallel-Meta Suite
   我们建议选择步骤 1.1 中自动安装的方式来配置PMS软件。但如果自动安装程序失败，可以按照步骤 1.2 中的步骤手动安装PMS软件。
   
   1.1

   自动安装（首选方案）

   1)

   下载对应操作系统的软件安装包
   Linux和WSL的下载命令：
   wget http://bioinfo.single-cell.cn/Released_Software/parallel-meta/3.7/parallel-meta-suite-3.7-src.tar.gz
   MacOS的下载命令：
   curl -O http://bioinfo.single-cell.cn/Released_Software/parallel-meta/3.7/parallel-meta-suite-3.7-src-mac.tar.gz
   

   2)

   解压缩
   使用以下命令对安装包进行解压缩：
   tar –xzvf parallel-meta-suite-3.7-src.tar.gz
   

   3)

   安装
   运行以下安装命令：
   cd parallel-meta-suite
   source install.sh
   按照上述步骤操作，该软件包可以在30分钟内安装到计算机上，安装成功后提示信息如下（图1）所示：
   
   
   图1. Parallel-Meta Suite安装成功提示信息
   
   示例数据集在安装包内“examples”文件夹下，可以查看“examples/Readme”中的内容来获取演示运行的详细信息，或直接运行：
   sh Readme
   来自动演示示例数据集的处理运行。Placeholder（如果对安装过程和示例演示有更多问题，请参阅附件）
   该示例数据集包含一个文件夹和三个文件，其中，seqs文件夹中存放的是需要分析的样本序列，seqs.list为每个样本对应的序列存放路径。（详见2.2小节），meta.txt为每个样本的meta信息（详见2.3小节）。
   1.2

   手动安装（备选方案）

   1)

   下载对应系统的安装包
   与1.1步骤一致。
   

   2)

   解压缩
   与1.1步骤一致。

   3)

   配置环境变量。
   将以下内容，写入环境变量配置文件（Linux和WSL系统一般是$HOME/.bashrc，Mac系统一般是$HOME/.zshrc）。
   export ParallelMETA=Path to Parallel-Meta Suite
   export PATH=”$PATH:$ParallelMETA/bin”
   export PATH=”$PATH:$ParallelMETA/Rscript”
   并启用环境变量（如Linux下）
   source ~/.bashrc

   4)

   安装R包
   Rscript $ParallelMETA/Rscript/config.R
   

   5)

   编译源代码
   cd parallel-meta-suite
   make
2. 输入格式
   2.1

   样本序列
   一个序列文件中包含单个样本的所有测序数据。PMS可以接受fastq和fasta格式的测序数据。序列可以是扩增子测序序列（单端或双端，包括16S rRNA gene、18S rRNA gene和ITS gene），也可以是宏基因组鸟枪法测序序列（shotgun metagenome）。
   
   2.2

   样本列表
   样本列表为纯文本格式文件，其中含有多个样本的ID和测序数据文件的地址路径（表1a）。该文件有两列信息，第一列为样本的ID，第二列表示每个样本测序数据文件的路径。为了保证路径的合法性，我们强烈建议使用绝对地址（即包含完整的路径名称，如表1a所示）。
   如果输入数据为双端测序序列，则需要在样本列表中为每个样本放置2个文件的地址路径（表1b）。此外，对于扩增子测序的双端序列，本文也强烈建议使用flash等工具先对两端序列进行合并，将合并后的新序列文件按照表1a的单端格式进行输入。
   
   表1. 文件列表格式 a. 单端测序序列

   Sample1	/home/data/sample1.fna
   Sample2	/home/data/sample2.fna
   Sample3	/home/data/sample3.fna
   SampleN	/home/data/sampleN.fna

   
   

   b. 双端测序序列

   Sample1	/home/data/sample1_end1.fna
   Sample1	/home/data/sample1_end2.fna
   Sample2	/home/data/sample2_end1.fna
   Sample2	/home/data/sample2_end2.fna

   2.3

   Meta信息
   “Meta”文件为纯文本格式文件，包含测序样本的meta信息，通常会有多列，其中第一列是样本的ID，其他列为meta信息的项目，如表2所示。需要注意的是，样本ID命名及其顺序需要与样本列表中的样本ID保持一致。
   
   表2. meta信息文件格式

   Sample_ID	IBD	Sex	Age
   Sample1	Crohns	Female	15
   Sample2	Crohns	Female	31
   Sample3	Health	male	29

   
   
3. 分析
   3.1

   自动化分析流程
   PMS具有一个图形化交互式的“配置向导”，位于程序包中的PMS-config文件夹中，其名称为“index.html”。用网页浏览器打开后可以看到其主界面，如图2所示。在初始状态下，所有的参数已设为默认值，只需填入必要的基本参数（如输入/输出类型和路径）就可以进行分析。也可以调整高级选项，以进一步对剖析、多样性分析和统计这些步骤进行定制。最后，根据用户的设置，该配置向导可以生成相应的可执行命令。
   在此，我们将展示PMS在不同计算平台和环境下的三个典型场景的使用情况和经验（图3）。需注意的是配置指南是可以独立运行的，配置过程可和分析过程可能在不同设备和环节下执行，但输入输出文件路径还是要以分析执行的设备为准。
   

   1)

   场景一：在本地使用配置向导进行参数配置，并在本地进行运算分析
   PMS可以在“本地”个人电脑（如笔记本电脑）中安装和执行，以处理少量样品（比如少于200；图3A）。该场景适用于Linux（安装GUI桌面）、Mac或Windows 10/11（需要安装Windows Subsystems for Linux）操作系统。配置完成后，通过点击页面底部的“Generate”和“Copy”按钮，就会生成一条有效的命令并复制到剪贴板中。然后将这个单行命令粘贴在本地终端，就可以成功运行PMS分析流程，而不需要进行其他操作。

   2)

   场景二：在本地使用配置向导进行参数配置，并在远程服务器上进行运算分析
   大量样本（比如大于1,000）的处理和运算需要更长的时间和更多的计算资源，我们建议在更强大的服务器上运行PMS的分析流程。通常这样的服务器需要远程登录（例如，通过SSH），并且只提供一个基于命令的终端来操作软件。在这种情况下（图3B），用户应在服务器上安装PMS，在本地计算机下载并打开配置向导（下载软件包中PMS-config文件夹，并用浏览器打开其中的“index.html”文件）以生成命令，并在远程服务器的终端上运行这些命令。因此，整个分析流程可以很容易地配置和执行，而无需大量的数据传输。
   
   
   图2. 配置向导页面

   
   

   3)

   场景三：使用命令行进行参数配置
   PMS也支持基于命令行的操作，此种方式通常是在没有GUI的条件下，或者针对有经验的用户（图3C）。整个分析流程可以在高度灵活的配置下工作，例如，用定制的参数运行每个步骤，或者只执行工作流程中的选定步骤。命令行界面还提供了教程，描述了详细的用法和分析流程在每个单一步骤中的简要帮助信息，可以通过“-h”参数来查看。以下命令是基于命令行操作中的简单范例：
   PM-pipeline -i seqs.list -m meta.txt -o output
   其中，PM-pipeline是PMS的自动化分析程序；“seqs.list”是输入的样本扩增子测序序列列表（表1），用“-i”指定；“meta.txt”是输入meta信息（表2），用“-m”指定；“output”是输出文件夹，用“-o”指定。
   
   
   图3. PMS在不同场景和平台的三种典型使用方式（A）在本机使用配置向导进行参数配置，并在本机进行运算分析；（B）在本机使用配置向导进行参数配置，并在远程服务器上进行运算分析；（C）使用命令行进行参数配置（本地和远程均可）
   

   
   
   3.2

   查看结果
   整个分析流程完成后，会在输出目录中自动创建结果导览，其文件名为“index.html”，可用网页浏览器打开。该页面会将所有分析结果分类（图4），为微生物组分析结果提供直接和清晰的解释。此外，在输出目录中，所有的原始结果（如相对丰度表、距离矩阵等）也会保留（表3），用于进一步深入的数据挖掘或元分析。此外，在结果文件夹中还提供了分析总结、工作日志和详细的分步工作流程脚本。
   
   
   图4. PMS的结果导览页面
   
   表3. 输出目录的文件列表

   文件/文件夹	内容
   Index.html	结果导览
   Sample_Views （文件夹）	群落结构可视化结果
   Abundance_Tables （文件夹）	样本丰度表
   Distance_Matrix（文件夹）	距离矩阵
   Clustring（文件夹）	聚类结果
   Alpha_Diversity（文件夹）	Alpha多样性分析结果
   Beta_Diversity（文件夹）	Beta多样性分析结果
   Markers（文件夹）	生物标记分析结果
   Network（文件夹）	共生网络分析结果
   Single_Sample（文件夹）	单个样本的群落结构及功能
   Single_Sample.List（文件夹）	样本中间结果列表
   Analysis_Report.txt	分析总结
   script.sh	分步工作流程脚本
   error.log	工作及错误日志

   
   
   3.3

   中间结果重分析
   除了测序序列之外，PMS还可以接受以中间结果作为输入，对其进行重分析，例如，以样本丰度表或中间结果列表作为输入（表3），从而避免了重复的序列处理所造成的计算时间和资源的消耗。在图2的配置向导中，选择输入类型为“Demultiplexed OTU Table List”，可将中间结果列表（例如，输出目录中“Single_Sample.List”文件夹下的“taxa.list”文件）作为输入；或者选择输入类型为“Combined OTU Table”，可将样本丰度表（例如，输出目录中“Abundance_Tables”文件夹下的“taxa.OTU.Count”文件）作为输入。此外，命令行操作中也有相应的输入格式，例如：
   PM-pipeline -l output/Single_Sample.List/taxa.list -m meta.txt -o output_new
   或者
   PM-pipeline -T output/Abundance_Tables/taxa.OTU.Count -m meta.txt -o output_new
   即为以上配置向导中等效的配置命令。
   
   
4. Parallel-Meta Suite的工作流程
   
   
   图5. PMS的工作流程
   
   PMS的分析工作流程如图5所示。PMS可以接受宏基因组的鸟枪序列或扩增子序列作为原始输入。对于鸟枪法测序序列，利用隐式马尔可夫模型(Mistry等， 2013)识别和提取标记基因片段（如16S rRNA或18S rRNA基因）。对于扩增子序列，PMS对标记基因进行ASV降噪(Callahan等， 2017)和去嵌合体(Edgar等， 2011)，以降低测序错误的干扰（这一步骤对于鸟枪法测序序列的默认设置是关闭，也可由用户自行开启）。然后，通过内置的vsearch(Rognes等， 2016)将序列与参考数据库进行比对，进行从界级到物种级的剖析和分类学注释。每个分类级别上群落成员的相对丰度也使用标记基因拷贝数进行校正。之后，使用PICRUSt算法(Douglas等， 2020)预测功能信息的KEGG Orthology（KO）基因家族，并通过KEGG BRITE层次结构对代谢途径进行注释。PMS还通过NSTI（Nearest Sequenced Taxonomy Index）值来衡量功能的预测准确性(Langille等， 2013)，NSTI是由OTU和它们在系统发育结构中最近的单独测序的亲属之间的距离之和计算出来。
   
   微生物组的物种信息通过Krona(Ondov等， 2011)和条形图进行可视化。然后，在用户选择的特定分类学或路径级别上进行微生物多样性分析、生物标记物选择和共现网络构建。α多样性分析计算每个样品的香农、辛普森和Chao1指数。对于离散的元数据（如类型、状态、性别等），α多样性指数进行Wilcoxon或Kruskal秩和检验，对于连续变量（如年龄、BMI、PH值等）进行回归分析。β多样性通过加权/非加权Meta-Storms(Su等， 2012)算法（针对物种分类）或Hierarchical Meta-Storms(Zhang等， 2021)（针对功能）计算所有样本之间距离矩阵，并通过热图进行可视化。之后，通过PCoA（主坐标分析）和PCA（主成分分析）图展示β-多样性模式，对离散元数据进行PERMANOVA和ANOSIM检验，对连续变量和距离值进行回归分析。在生物标志物分析中，PMS使用Wilcoxon或Kruskal秩和检验，选择出在不同组别（离散数据变量）间具有显著差异的微生物或基因单元作为候选标记物，然后通过随机森林(Vangay等，2019; Qian等，2020)的重要性进行排序。与连续变量密切相关的微生物组特征也通过回归分析被挑选出来作为生物标志物。在共现网络中，网络节点是群落特征（例如，一个微生物分类单元），网络的边代表节点间的Spearman相关性，然后计算网络密度、直径、半径和集中度来量化网络属性。
   

结果与分析

为了证明PMS在解码微生物组概况和将生态模式与关键meta数据联系起来的能力，这里选取了医院开业前后室内微生物组的变化验证。所有的数据集均可在 PMS 软件下载页面的“Supplementary”部分中下载。
该数据集包含894个来自医院开业前后室内环境的16S-扩增子微生物组样本。我们用所有的默认参数执行了PMS分析流程。从结果中我们可以观察到，医院开放后，α多样性的香农指数下降（图6A；Wilcoxon检验p值<0.01），整体群落的β多样性明显转变（图6B；加权Meta-Storms距离，PERMANOVA检验p值<0.01），均已被Lax等人(Lax等， 2017)验证过。两个时间点之间的这种微生物动态也可以通过相对丰度的变化来说明（图6C）。使用统计测试和机器学习分析方法，PMS还确定了有助于区分医院表面从开业前到开业后状态的这种生态变化的最重要的微生物，如葡萄球菌、莱茵海拉菌和莫德斯特菌。这个机器学习模型在区分室内样本（图6D）的属级状态方面达到了95.91%的准确率（误差率=4.09%）。


图6. 医院开业前后室内微生物组的变化
（A）医院开业后，α多样性的香农指数下降，Wilcoxon测试P值<0.01（P值<0.05表示差异显著）；（B）根据加权的Meta-Storms距离，开院前和开院后状态下的整体β多样性有显著差异，PERMANOVA检验P值<0.01（P值<0.05表示有显著差异）；（C）两个时间点之间属水平的相对丰度的动态变化；（D）五种细菌属被选为可以区分两个时间点的生物标志物。X轴是随机森林模型产生的重要性得分（准确性的平均下降），该模型评估了每个生物标志物对区分不同医院状态的重要性

失败经验

问题1
安装提示：”make: g++: command not found”
问题原因：没有安装Parallel-Meta Suite所需要的g++编译器。
解决方法：根据不同的操作系统，利用相应的命令安装 g++，常见的操作系统：
Ubuntu Linux系统：sudo apt-get install g++
CentOS Linux系统：sudo yum install g++
Mac OS 系统：通过App Store安装Xcode应用程序

问题2
运行提示：”Please set the environment variable ParallelMETA to the directory”
问题原因：环境变量设置失败。
解决方法：请参考实验步骤 1.2.2 中手动配置环境变量的方法将 Parallel-Meta Suite 所需要的环境变量添加到配置文件中。

问题3
运行提示：”PM-pipeline: command not found”
问题原因：环境变量设置失败。
解决方法：请参考实验步骤 1.2.2 中手动配置环境变量的方法将 Parallel-Meta Suite 所需要的环境变量添加到配置文件中。

问题4
运行提示：”Error: Cannot open file: XXX”
问题原因：输入了错误的输入/输出文件路径。
解决方案：请检查正确的输入文件路径(可在输入时用Tab 键自动补全)，并确保用户在输出路径下有足够的写权限。

问题5
运行提示：”Argument #X Error : Arguments must start with -”
问题原因：运行命令中所有参数选项名称必须以“-”开头。
解决方法：请检查第 X 个参数并更正。

问题6
运行提示：
vsearch: unrecognized option '--cluster_unoise'
Error: Cannot open file: ./Result/tmp/denoised
vsearch: unrecognized option '--uchime3_denovo'
Error: Cannot open file: ./Result/tmp/nonchimeras
vsearch: unrecognized option '--otutabout'
Profiling finished
Error: Open Mapping File error : ./Result/tmp/map_output.txt
问题原因：用户使用PMS软件时，系统自动调用了默认环境的vsearch，而该vsearch的版本与PMS中所需的vsearch版本（v2.15.1）不同。
解决方法：更换环境变量中vsearch变量值，或者更新默认环境下vsearch版本。

问题7
运行提示：
Installing package into ‘/usr/local/lib/R/site-library’ (as ‘lib’ is unspecified)
Warning in install.packages(p, dep = TRUE, repos = “http://cran.us.r-
project.org/”) :
'lib = “/usr/local/lib/R/site-library”' is not writable
Error in install.packages(p, dep = TRUE, repos = “http://cran.us.r-project.org/”) :
unable to install packages
问题原因：R包的安装存在问题，用户对该文件夹没有”写”权限，需要改变/usr/local/lib/R/site-library文件夹的权限或者更换R library位置。
解决方法：
方案一：增加文件夹权限
step1: 进入文件夹
cd /usr/local/lib/R
step2: 加权限
sudo chmod o+w site-library
step3: 检查权限
ls -l
step4: 输出行如下
drwxrwsrwx xxxxxxxxxx(省略) site-library
方案二：以管理员身份进入
step1: su root
step2: 输入密码进入
step3: 再次执行命令

问题8
运行提示：出现”Installing package into “usr/local/lib/R/site-library” (as lib is unspecifed)”之后出现很多代码，一直在刷新
问题原因：PMS画图依赖一些R包，这时是在安装R包。
解决方法：如果安装了很长时间R包还是没有下载好，建议用户更换下载R包的源（如清华）。打开Rscript文件夹下的config.R文件，更换usePackage函数
（文件中第13-17行）为以下内容：
usePackage <- function(p) {
if (!is.element(p, installed.packages()[,1]))
install.packages(p, dep=TRUE, repos=“https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/”)
suppressWarnings(suppressMessages(invisible(require(p, character.only=TRUE))))
}

问题9
运行提示：randomForest包安装不成功，用”install.packages(“randomForest”,
dep=TRUE, repos=“https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/”)”命令单独安
装后报错：-bash: syntax error near unexpected token ”randomForest”
问题原因：没有进入R环境就直接执行安装命令
解决方法：
step1:
输入R后回车
step2:
显示R version 3.6.x xxxxx等一系列提示信息后，输入
install.packages(“randomForest”, dep=TRUE,
repos=“https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/”)
回车后根据提示进行操作就可以。

问题10
运行提示：
“There are 0 sequences in total
Profiling starts
Profiling finished
0 matches are parsed
0 taxonomy annotations are parsed out”
问题原因：在当前执行命令的路径下找不到seqs.list中的文件地址。
以PMS样例数据举例，执行命令地址为 /home/username，输入正确路径
/mnt/d/parallel-meta-suite/example/seqs.list（meta同理）后生成如下命令：
PM-pipeline -i /mnt/d/parallel-meta-suite/example/seqs.list -m /mnt/d/parallel-
meta-suite/example/meta.txt
但seqs.list样本地址为seqs/S0437C.fna,在当前执行命令地址/home/username
下找不到seqs/S0437C.fna，因此运行后会出现这种错误。
解决方法：
方案一：切换到seqs.list、meta.txt、seq文件夹所在的位置再次执行
PM-pipeline –i seqs.list –m meta.txt
方案二：更换seqs.list中每个样本的地址。按照前面的路径举例，如果
在/home/username下执行，那么seqs.list中S0437C样本对应的地址是
/mnt/d/parallel-meta-suite/example/seqs/S0437C.fna，其他同理。

问题11
运行提示：运行完成后，打开文件夹中PDF文件，显示PDF文件已损坏或
该文件可能已被移除至别处、修改或删除
问题原因：R包安装未成功导致调用相应R包时出错，无法画图，因此该文
件为空无法打开显示
解决方法：根据error.log文件中的报错，重新安装需要的R包。如果有很多
R包都未安装成功，建议按照前面换清华源的步骤操作后再次执行“Rscript
config.R”以重新安装R包。

问题12
运行提示：软件分析的结果中只有Phylum（门）和Genus（属）层的分析结果，能否直接得到样品全部分类层次的信息？
问题原因：PMS默认只输出Phylum（门）和Genus（属）层的分析结果，可以在分析参数中指定任意多个层次。
解决方法： 在3.1配置向导“Diversity”类别的“Taxonomy Level”项中，选中任意多个层次（图7）；或者在PM-pipeline命令中，用“-L”参数指定任意多个层次。


图7. 配置向导中指定任意多个分类层次

致谢

本项工作得到了国家重点研发计划2021YFF0704500、国家自然科学基金31771463和32070086项目的支持。

参考文献

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