细胞冻存

一、视频摘要

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 利用冻存技术将细胞置于-150℃超低温冰箱中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

二、关键词

细胞；细胞冻存；细胞培养

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

细胞

2. 试剂和耗材

冻存液，DMEM培养基

3. 仪器和软件

移液枪，酒精灯

四、实验操作

(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5～10%)，使细胞浓度为1～5×10⁶cells/ ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

五、注意事项

1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0. 22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小体积分装，4 ℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。