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基于Langendorff灌流法分离成年小鼠原代心肌细胞

李聪, 石博中, 陈博 和 曾国炜 |  2023-12-08  | DOI: 10.21769/BioProtoc.v1383
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视频简介一、视频摘要
心血管疾病是威胁人类生命健康的第一杀手,小鼠原代心肌细胞一直以来是心脏生理和病理学研究的重要工具,因此掌握心肌细胞体外分离实验技术至关重要。通过Langendorff灌流法获得的原代心肌细胞纯度高、活性好且形态佳,本实验将通过视频来介绍Langendorff灌流法的实验原理、步骤和注意事项。

二、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
8周龄C57BL/6J小鼠

2. 试剂和耗材

试剂:
肝素钠溶液;
无钙台式液;
酶解液(蛋白酶、胶原酶)

耗材:
1ml 注射器;
20G灌注针头;
15ml和50ml离心管;
10cm培养皿;
显微手术器械;

3. 仪器和软件
Langendorff灌流设备;
体式显微镜
  • 视频介绍

一、视频摘要

心血管疾病是威胁人类生命健康的第一杀手,小鼠原代心肌细胞一直以来是心脏生理和病理学研究的重要工具,因此掌握心肌细胞体外分离实验技术至关重要。通过Langendorff灌流法获得的原代心肌细胞纯度高、活性好且形态佳,本实验将通过视频来介绍Langendorff灌流法的实验原理、步骤和注意事项。

 

 

二、关键词

Langendorff;成年小鼠;原代心肌细胞

 

三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

8周龄C57BL/6J小鼠

 

2. 试剂和耗材

试剂:

肝素钠(biosharp);

无钙台式液(国药,碧云天,阿拉丁);

蛋白酶(Signa;

2型胶原酶(Worthington

耗材:

1ml 注射器;

20G针头;

15ml50ml离心管;

10cm培养皿;

显微手术器械;

 

3. 仪器和软件

Langendorff灌流设备;

体式显微镜

 

四、实验操作

1. 用肝素钠腹腔注射8C57BL/6J小鼠,肝素化10分钟后,脱颈处死,将小鼠仰卧并固定在手术台上,迅速打开胸腔,游离心脏和主动脉,留出足够长度主动脉后,剪断上下腔静脉、主肺动脉、肺静脉,取出心脏;心脏离体后迅速放置于4℃无钙台式液中,此时心脏将逐渐冷停跳;

2、将心脏置于体式显微镜下,将主动脉结扎于20G针头上,注意不要堵住冠状动脉开口以及插入过深进入左心室。通过针头注射0.5ml左右无钙台式液,排除心腔和冠脉内残血。注意心脏离体后在3min内恢复灌注。

3、将心脏转移到Langendorff的第一个液流通路中(该通路充满无钙台式液),以37℃,2-3ml/min流速进行灌流,进行排气排血灌流2min左右。随后,将心脏转移至第二个液流通路(酶解通路,该通路充满消化酶),同样地,以37℃,2-3ml/min流速进行灌流酶解10min 左右,注意过程中检查心脏软硬程度。10分钟后,心脏变的柔软,此时剪下左右心室组织,镜下观察是否有游离单个心肌细胞。

4、后续操作转移至超净台中操作,将心脏撕碎,予以Stop Buffer停止消化,使用巴氏吸管吹打撕碎的心肌组织至单细胞混悬液。将混悬液通过100um滤网过滤后,分装至215ml离心管中重力沉降10min。重力沉降后,管中上层液体为非心肌细胞(成纤维细胞为主)以及死亡的心肌细胞,管中沉淀为活性较好的心肌细胞。吸除上清,重悬沉淀,检查心肌细胞形态和活性,后续可根据实验需要进行裂解或培养。

五、注意事项

1、心脏离体后浸泡在冰浴台式液中,尽量在3min内恢复灌注

2、灌流温度控制在37℃,流速控制在2-3ml/min

3、灌注不佳,心脏不够“柔软”:①更换新批次蛋白酶或胶原酶;②针头排空气泡③增加肝素用量④延长灌注消化时间

4、细胞活性低、形态差:①使用≥18.2MΩ.cm dd水②调整pH③减少灌注消化时间④更换新批次胎牛血清

 

六、参考文献

1. Zhang, H., & Rabinovitch, P. S. (2022). Protocol for Isolation of Cardiomyocyte from Adult Mouse and Rat. Bio-protocol, 12(10), e4412.

2. Ackers-Johnson, M., Li, P. Y., Holmes, A. P., O'Brien, S. M., Pavlovic, D., & Foo, R. S. (2016). A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse He
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