基于Langendorff灌流法分离成年小鼠原代心肌细胞

一、视频摘要

心血管疾病是威胁人类生命健康的第一杀手，小鼠原代心肌细胞一直以来是心脏生理和病理学研究的重要工具，因此掌握心肌细胞体外分离实验技术至关重要。通过Langendorff灌流法获得的原代心肌细胞纯度高、活性好且形态佳，本实验将通过视频来介绍Langendorff灌流法的实验原理、步骤和注意事项。

二、关键词

Langendorff;成年小鼠;原代心肌细胞

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

8周龄C57BL/6J小鼠

2. 试剂和耗材

试剂：

肝素钠(biosharp);

无钙台式液(国药,碧云天,阿拉丁);

蛋白酶（Signa）;

2型胶原酶（Worthington）

耗材：

1ml 注射器；

20G针头；

15ml和50ml离心管；

10cm培养皿；

显微手术器械；

3. 仪器和软件

Langendorff灌流设备;

体式显微镜

四、实验操作

1. 用肝素钠腹腔注射8周C57BL/6J小鼠，肝素化10分钟后，脱颈处死，将小鼠仰卧并固定在手术台上，迅速打开胸腔，游离心脏和主动脉，留出足够长度主动脉后，剪断上下腔静脉、主肺动脉、肺静脉，取出心脏；心脏离体后迅速放置于4℃无钙台式液中，此时心脏将逐渐冷停跳；

2、将心脏置于体式显微镜下，将主动脉结扎于20G针头上，注意不要堵住冠状动脉开口以及插入过深进入左心室。通过针头注射0.5ml左右无钙台式液，排除心腔和冠脉内残血。注意心脏离体后在3min内恢复灌注。

3、将心脏转移到Langendorff的第一个液流通路中（该通路充满无钙台式液），以37℃，2-3ml/min流速进行灌流，进行排气排血灌流2min左右。随后，将心脏转移至第二个液流通路（酶解通路，该通路充满消化酶），同样地，以37℃，2-3ml/min流速进行灌流酶解10min 左右，注意过程中检查心脏软硬程度。10分钟后，心脏变的柔软，此时剪下左右心室组织，镜下观察是否有游离单个心肌细胞。

4、后续操作转移至超净台中操作，将心脏撕碎，予以Stop Buffer停止消化，使用巴氏吸管吹打撕碎的心肌组织至单细胞混悬液。将混悬液通过100um滤网过滤后，分装至2个15ml离心管中重力沉降10min。重力沉降后，管中上层液体为非心肌细胞（成纤维细胞为主）以及死亡的心肌细胞，管中沉淀为活性较好的心肌细胞。吸除上清，重悬沉淀，检查心肌细胞形态和活性，后续可根据实验需要进行裂解或培养。

五、注意事项

1、心脏离体后浸泡在冰浴台式液中，尽量在3min内恢复灌注

2、灌流温度控制在37℃，流速控制在2-3ml/min

3、灌注不佳，心脏不够“柔软”：①更换新批次蛋白酶或胶原酶；②针头排空气泡③增加肝素用量④延长灌注消化时间

4、细胞活性低、形态差：①使用≥18.2MΩ.cm dd水②调整pH③减少灌注消化时间④更换新批次胎牛血清

六、参考文献

1. Zhang, H., & Rabinovitch, P. S. (2022). Protocol for Isolation of Cardiomyocyte from Adult Mouse and Rat. Bio-protocol, 12(10), e4412.