人外周血中性粒细胞的分离

取新鲜抗凝人外周全血，平铺于分离液的梯度界面之上，离心后取中性粒细胞层，用细胞洗涤液清洗细胞后，加入红细胞裂解液去除红细胞，再用细胞洗涤液清洗细胞后，用细胞培养液重悬细胞并镜下观察。

对分离后的细胞进行Ly6G/6C-PE-多抗和CD11b-FITC-多抗双染后，用流式细胞仪检测人中性粒细胞的纯度。结果表明中性粒细胞测定的纯度达到90%以上，可用作后续实验。

二、关键词

密度梯度离心法、提取中性粒细胞、人外周血

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
3.1 实验样品信息
采用健康志愿者的新鲜血液
3.2 试剂和耗材
试剂：
人外周血中性粒细胞分离试剂盒（TBDscience, China）（分离液试剂A、C，红细胞裂解液，细胞洗涤液）
RPMI 1640细胞培养基（Bio-protocol, China）
耗材：
50ml离心管、15ml离心管、1ml枪头、10ml巴氏管
3.3 仪器
流式细胞仪（BD, USA），离心机，显微镜

四、实验操作
4.1 取新鲜抗凝人外周全血15 cc。
4.2 准备一支离心管，依次加入10 ml试剂A，后小心叠加5 ml试剂C，形成梯度界面。用巴氏徳吸管小心吸取血液平分铺在分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。
4.3 低温，1000 g，离心30 min。
4.4 离心后，稀释液层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状中性粒细胞层移至新的离心管。
4.5 加入2-3倍体积的细胞洗涤液混匀。400 g，离心10 min，弃上清。
4.6 加入3-4ml红细胞裂解液重悬，4℃冰箱裂解10 min。300 g，离心10 min，弃上清。
4.7 重复步骤4.5，用细胞培养基重悬细胞备用。

五、注意事项
5.1 在分离液上方平铺血液，形成梯度界面时，如果样品较多，加样的时间较长，在离心前出现红细胞成团下沉属正常现象。
5.2 离心结束后出现分层现象时，由于个体差异或者分离条件不同，粒细胞层分离可能会不明显。
5.3 在红细胞裂解过程中，红细胞是否裂解彻底取决于红细胞裂解液的处理量和处理时间，若裂解过度将影响中性粒细胞活性，出现成团现象；若裂解不彻底，过多红细胞会影响后续实验。

六、实验结果

1.镜下观察
 
图1 分离后的细胞（低倍镜）




图2 分离后的细胞（高倍镜）




图2 分离后的细胞（高倍镜）

2.流式
对分离后的细胞进行Ly6G/6C-PE-鼠多克隆抗体和CD11b-FITC-鼠多克隆抗体双染后，用流式细胞仪检测人外周血中性粒细胞的纯度。检测结果为CD11b+Ly6G/6C+的细胞占总细胞的93.1%，分离得到的细胞可以用于后续实验。



注：
a：空白对照组；b：Ly6G/6C-PE-多抗单染组；

c：CD11b-FITC-多抗单染组；d：CD11b-FITC-多抗和Ly6G/6C-PE-多抗双染组