一、视频摘要
角膜盲是全世界范围内人们失明的主要原因之一，而培养的人角膜上皮细胞已成功用于角膜重建[1]。角膜上皮细胞是从外周向中心迁移到角膜表面中心[2,
3]。角膜上皮的这种更新现象是由位于角膜缘的干细胞引起的。角膜缘基底细胞含有干细胞亚群，其特点是在损伤或培养后具有高自我更新能力、慢细胞周期和高增殖潜能[4,
5]。角膜缘上皮细胞的外科移植能够恢复正常的角膜表型，促进血管化和炎症的消退以及光学清晰度的提高[6]。本视频将展示利用角膜移植后剩余角膜组织分离与培养人原代角膜上皮细胞的操作流程。
二、关键词
原代角膜上皮、角膜干细胞
三、实验样品信息、耗材、试剂或工具
样品信息：
角膜移植手术后剩余人角膜环组织
耗材与试剂：
1.
12孔板
2.
35mm培养皿
3.
D-Hanks缓冲液（Solarbio,
H1045-500）
4.原代角膜上皮细胞培养基（ScienCell，6511）
5.青霉素-链霉素（gibco,
15070063）
工具：
1. 角膜剪
2. 有齿镊
3. 无齿镊
四、实验操作
1.核对标本信息——取材时间、眼别和年龄。
2.用有齿镊取出角膜置于35mm培养皿中，用含1%双抗的D-Hanks缓冲液冲洗角膜环。
3.用有齿镊与角膜剪修剪角膜环上的虹膜组织。
4.再次用含1%双抗的D-Hanks缓冲液冲洗角膜环。
5.用角膜剪与无齿镊垂直于角膜缘剪断角膜环，然后沿角膜缘距内侧约2mm分离角膜缘。
6.用角膜剪将上步分离的角膜缘剪成大小约2×2mm大小的组织块。
7.用含1%双抗的D-Hanks缓冲液冲洗组织块。
8.用无齿镊将组织块上皮面贴附于12孔板内。
9.每一个组织块上滴一滴原代角膜上皮细胞培养基或者胎牛血清。
10.第二天添加约200μl原代角膜上皮细胞培养基。
11.之后每2-3天更换一次原代角膜上皮细胞培养基。
五、注意事项
-
我们用于原代角膜上皮培养的角膜环，取材时间最久为捐献后15天。
-
在组织块上滴胎牛血清和原代角膜上皮细胞培养基没有发现明显差别。
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为了更准确剪切角膜环，可在显微镜下操作，但要注意无菌操作，防止发生污染。
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迁移出细胞的组织块可再次贴壁进行细胞分离。
-
分离出的人角膜上皮细胞可以传代并通过酶消法进行纯化。
六、结果分析
镜下观察：贴壁细胞即为传代角膜上皮
参考文献
1. Kim,
H.-S., et al.,Phenotypic characterization of human corneal
epithelial cells expanded ex vivo from limbal explant and single cell
cultures.Experimental Eye Research, 2004.79(1): p.
41-49.
2. Cotsarelis,
G., et al.,Existence of slow-cycling limbal epithelial basal
cells that can be preferentially stimulated to proliferate:
implications on epithelial stem cells.Cell, 1989.57(2):
p. 201-209.
3. Davanger,
M. and A. Evensen,Role of the pericorneal papillary structure in
renewal of corneal epithelium.Nature, 1971.229(5286): p.
560-561.
4. Dua,
H.S. and A. Azuara-Blanco,Limbal stem cells of the corneal
epithelium.Survey of Ophthalmology, 2000.44(5): p.
415-425.
5. Lavker,
R.M. and T.T. Sun,Epidermal stem cells: properties, markers, and
location.Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 2000.97(25): p. 13473-13475.
6. Kenyon,
K.R. and S.C. Tseng,Limbal autograft transplantation for ocular
surface disorders.Ophthalmology, 1989.96(5).
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