细胞冻存实验操作

一、视频摘要

成功冻存细胞是细胞培养研究的一个重要方面。冻存过程中，冻存技术是影响后续细胞培养成功与否的关键因素。细胞冻存技术与操作方法的学习，不仅是初学者应该掌握的基本技术，也是提高实验结果和效率的基础。

二、关键词

细胞冻存；贴壁细胞；冻存液；梯度降温

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

贴壁细胞

2. 试剂和耗材

试剂：DMSO；培养液；血清；胰酶；PBS

耗材：移液枪；枪头；EP管；冻存管；封口膜；冻存盒

3. 仪器和软件

离心机；冰箱

四、实验操作

1、 吸出旧培养液加PBS冲洗2次

2、胰酶消化

3、加含有血清的培养基中止消化。

4、离心细胞悬液，1000r 5分钟。
5、吸出离心管上清液，先按比例在冻存管中配好DMSO和血清的混合液，再按比例加入培养液重悬细胞，移到冻存管中。也可直接加1.5mL的冻存液重悬细胞。
6、冻存，放冰箱，4度半小时，-20度两小时，-80度过夜，或直接放入冻存盒中过夜，再放液氮长期保存。

五、注意事项

1）细胞冻存前增殖能力不强怎么办？
用10%-90%的血清维护细胞活力，并且提高每份冻存的细胞数量。

2）什么状态的细胞可以冻存？
选择细胞的最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。不要选择以下情况的细胞：细胞融合度近100%;培养液变黄；细胞可疑污染；细胞开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变等。

3）冻存液如何配置？
可以按照1：3：6的比例来配置。即1份DMSO；3份血清和6份培养液。

4）缓慢降温操作如何操作？
加入冻存液的细胞悬液放入程序降温盒保存至-80℃过夜，缓慢降温，第二天取出并放入液氮罐中长期保存。若没有程序降温盒，可以人工梯度降温。先在4℃冰箱放置30 min，然后转移至-20℃放置1-2 h，最后转移至-80℃过夜，第二天取出并放入液氮罐中长期保存。

5）注意DMSO的加入顺序：
DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。可以先加入血清，再加DMSO，最后加培养基。

6）冻存管如何处理？
准备适量冻存管，操作前应先置于4℃冰箱预冷。操作完毕后，冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。

7）冻存管内细胞的浓度是多少，才能成功的复苏细胞？
细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升复苏存活率，推荐密度为为5*10⁶-1*10⁷/ml。

8）常规基本检查操作：每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。冻存盒要恢复到室温后在进行使用。