一、视频摘要
成功冻存细胞是细胞培养研究的一个重要方面。冻存过程中,冻存技术是影响后续细胞培养成功与否的关键因素。细胞冻存技术与操作方法的学习,不仅是初学者应该掌握的基本技术,也是提高实验结果和效率的基础。
二、关键词
细胞冻存;贴壁细胞;冻存液;梯度降温
三、实验样品信息,试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
贴壁细胞
2. 试剂和耗材
试剂:DMSO;培养液;血清;胰酶;PBS
耗材:移液枪;枪头;EP管;冻存管;封口膜;冻存盒
3. 仪器和软件
离心机;冰箱
四、实验操作
1、
吸出旧培养液加PBS冲洗2次
2、胰酶消化
3、加含有血清的培养基中止消化。
4、离心细胞悬液,1000r
5分钟。
5、吸出离心管上清液,先按比例在冻存管中配好DMSO和血清的混合液,再按比例加入培养液重悬细胞,移到冻存管中。也可直接加1.5mL的冻存液重悬细胞。
6、冻存,放冰箱,4度半小时,-20度两小时,-80度过夜,或直接放入冻存盒中过夜,再放液氮长期保存。
五、注意事项
1)细胞冻存前增殖能力不强怎么办?
用10%-90%的血清维护细胞活力,并且提高每份冻存的细胞数量。
2)什么状态的细胞可以冻存?
选择细胞的最佳时机:细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。不要选择以下情况的细胞:细胞融合度近100%;培养液变黄;细胞可疑污染;细胞开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月,细胞性状已有改变等。
3)冻存液如何配置?
可以按照1:3:6的比例来配置。即1份DMSO;3份血清和6份培养液。
4)缓慢降温操作如何操作?
加入冻存液的细胞悬液放入程序降温盒保存至-80℃过夜,缓慢降温,第二天取出并放入液氮罐中长期保存。若没有程序降温盒,可以人工梯度降温。先在4℃冰箱放置30
min,然后转移至-20℃放置1-2
h,最后转移至-80℃过夜,第二天取出并放入液氮罐中长期保存。
5)注意DMSO的加入顺序:
DMSO溶于培养基时,将释放大量热量,所以冻存液需提前配制,不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中,避免烫伤细胞。可以先加入血清,再加DMSO,最后加培养基。
6)冻存管如何处理?
准备适量冻存管,操作前应先置于4℃冰箱预冷。操作完毕后,冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。
7)冻存管内细胞的浓度是多少,才能成功的复苏细胞?
细胞冻存和复苏过程中,不可避免会损失部分细胞,所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升复苏存活率,推荐密度为为5*106-1*107/ml。
8)常规基本检查操作:每支冻存管都标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。冻存盒要恢复到室温后在进行使用。
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