HUVEC成管实验和结果分析

一、视频摘要

血管生成（Angiogeneseis）是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展形成新的血管，在器官生长、胚胎发育、肿瘤生长等多种过程中都起着重要的作用。成管实验（tubeformation）是一种体外评估血管生成能力的经典方法。本视频主要介绍了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）成管实验的具体操作步骤和图像采集分析过程。

二、关键词

HUVEC细胞，成管实验，血管生成。

三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器

1. 样品信息

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）

2. 试剂和耗材

试剂：

1）DMEM培养基

2）胎牛血清

3）基质胶

4）含EDTA胰蛋白酶消化液

耗材：

1）96孔板

2）灭菌移液器枪头

3）灭菌1.5ml EP管

4）冰盒，冰板

3. 仪器和软件

1）细胞培养箱

2）超净工作台

3）倒置显微镜

4）图像采集设备

5）Image J软件及angioanalyzer插件

四、实验操作

1）HUVEC细胞的培养：本实验中采用含有10%的DMEM高糖培养基培养HUVEC细胞，细胞汇合度为80%进行传代。细胞在7代以内进行成管实验效果最佳。为加强成管效果，可于实验前一天对细胞进行饥饿处理。

2）基质胶的分装：基质胶储存于-20℃条件，于0℃后开始由固态转变为液体，超过10℃就会凝固成具有生物学活性的三维基质，且反复冻融会影响基质胶品质，因此未开封的基质胶应先进行分装处理。

分装过程如下：

①提前一天，将未拆封、冷冻状态下的基质胶放置于有碎冰的泡沫盒中，放进4℃冰箱隔夜融化。

②提前1小时，将分装基质胶所用到的耗材（如枪头、1.5ml EP管）放进-20℃环境预冷。

③开始分装前，将已融化的基质胶和预冷的耗材放进超净台，置于事先喷酒精消毒后的冰盒和冰板上，保证分装过程全程冰上操作。

④拆开基质胶包装，注意手持包装上部，避免体温使下部的胶体升温。按每次实验所需量将基质胶分装至EP管中，迅速冷冻于-20℃保存，避免反复冻融。

3）铺胶：

①基质胶隔夜融化及耗材预冷（包括96孔板）步骤同上。

②将适量融化好的基质胶和预冷耗材置于超净台内喷洒过酒精的冰盒上。依据不同产品，有些基质胶需要用预冷的无血清培养基进行稀释，详见产品说明或咨询厂家。吹打混匀稀释的基质胶时一定注意避免吹入气泡，如已形成气泡，可短暂低俗离心。

③向预冷的96孔板中，每孔加入50ul基质胶，注意枪头直接插到底，避免使基质胶挂于侧壁。可使用反向移液法，以避免基质胶中产生气泡。

④加好基质胶后，轻轻拍打96孔板，使液面均匀平整，放置于37℃细胞培养箱中孵育30分钟至1小时（根据产品说明）。

4）细胞准备：

①等待基质胶凝固的过程中，准备HUVEC细胞。使用胰蛋白酶消化液消化细胞，1000rpm离心3分钟后重悬细胞，并进行细胞计数。

②按照96孔板每孔约2.0×10⁴-3.0×10⁴个细胞、100ul培养基的体系重悬细胞。实际实验中，每孔细胞量应按需求提前进行摸索。

③基质胶凝固后，向每孔基质胶上轻轻滴入事先准备好的细胞悬液，注意动作轻柔，避免冲力过强而损坏基质胶平整的表面。注意HUVEC细胞易沉降，每次添加细胞前都应充分吹打均匀，以免每孔细胞数量差异过大。每个实验组设置3个复孔。

④铺好细胞后的96孔板放进细胞培养箱进行成管实验。

5）图像采集和分析

①铺好细胞后4个小时即可开始进行观察，使用图像采集设备直接采集明场下的成管图片，也可用4%多聚甲醛固定后再进行拍照。

②使用image J软件，安装angioanalyzer插件后对所采集的图像进行图像分析，并获得相应数据。

五、注意事项

1）关于基质胶的处理，如是否稀释、凝固时间，按不同生厂商及同一产品的不同批次应有所区别，具体应详细咨询厂商，特别是本批次基质胶的浓度。

2）基质胶分为正常生长因子和低生长因子，根据实验需求，注意是否需要选择低生长因子的基质胶以排除生长因子的干扰。

3）如果在96孔板中加完基质胶，发现表面呈凹面，拍照时成管的细胞很难在同一焦面，可以尝试以下操作：①96孔板中适当多加一些基质胶，如60-70ul，使液面变平；②若科研经费充足，可改用48孔板，加入对应量的基质胶，可获得更大的图像采集面积。

六、结果分析（可选）

七、参考文献（可选）

Brown RM, Meah CJ, Heath VL, Styles IB, Bicknell R. Tube-Forming Assays. Methods Mol Biol. 2016;1430:149-57. doi: 10.1007/978-1-4939-3628-1_9. PMID: 27172951.